范慧寧，瞿國強

（1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內科，上海 200233；2.上海健康醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院東院消化內科，上海 201306）

小腸菌群對宿主生理的各個方面包括免疫、代謝和內分泌功能有著深遠的影響［1］，負責從飲食中吸收90%的能量供應身體機能，特別是回腸末端包含著最大的淋巴結組織，包括內臟相關淋巴組織和Peyer's patches，這些組織對維持微生物平衡調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)至關重要［2］。然而，有關人小腸菌群的信息有限，其特點是其相對較低的密度（102～107個／g），腔內小腸液流動和分泌部分腸道內殺菌物質［3］。此外，因為解剖學的特點，小腸部位的微生物樣本收集很具挑戰(zhàn)性，對小腸分布的菌群情況所知甚少。近年來，小腸微生物群的組成與健康和胃腸疾病的關系日益受到重視，本研究通過對胃腸鏡獲得的樣本進行基于16S rRNA 的健康人群球部和末端回腸黏膜菌群多樣性分析，為小腸功能及疾病的治療提供一定的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇上海健康醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院東院消化內鏡中心行胃腸鏡檢查的患者作為研究對象?；颊吣挲g為 21～50 歲，平均（32±0.2）歲；BMI 為 20 ～24 kg／m2。男女不限，比例相當，其中男27 例，女 26例，兩組間研究對象一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有入選對象均被告知并簽署知情同意書。胃鏡檢查留取十二指腸球部黏膜正常的組織；腸鏡檢查留取末端回腸黏膜正常的組織。球炎及末端回腸炎患者納入對象：內鏡下消化道黏膜有充血紅腫、糜爛表現(xiàn)，病理組織學診斷提示黏膜組織慢性炎癥。疾病史：既往體健。藥物史：近 1 個月未使用以下藥物：抗生素；微生態(tài)制劑；抑制胃酸分泌藥物；免疫抑制劑等；激素類；其它影響胃內菌群的藥物。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 對于符合標準的對象，使用無菌活檢鉗鉗取2 塊，使用一次性無菌注射器針頭使標本從活檢鉗轉移至無菌凍存管內，做好標記。-80 ℃冰箱保存。通過Excel 表格整理總結研究對象的一般資料，包括人口信息學、內鏡結果、病理結果等。

1.2.2 微生物總DNA 提取 1 個月內，樣本集齊后，使用干冰將樣品寄送至送上海派森諾公司進行16SDNA 測序。

1.2.3 PCR 擴增細菌16SDNA 基因功能基因的不同區(qū)域 在該實驗中，選用了細菌16S rRNA 基因的高度可變的V4 區(qū)用來測序，其長度約為250 bp。PCR 擴增選用細菌16S rDNA V4 區(qū)特異性引物，520F（5′?barcode ＋AYTGGGYDTAAAGNG?3′），802R（5′?TACNVGGGTATCTAATCC?3′）。前引物中的barcode 用來區(qū)分同一文庫中的不同樣品。PCR 運用NEB Q5 DNA 高保真聚合酶，對擴增結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并切取目的片段，然后使用Axygen 凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 PCR產物定量、混樣利用Quant?iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 對 PCR 物在 Microplate reader（BioTek 公司，F(xiàn)Lx800）上進行定量，然后計算每個樣品所需數(shù)量進行配比。

1.2.5 文庫構建 該過程是利用 Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進行建庫。

1.2.6 文庫質檢與測序 （1） 文庫質檢與定量。取1 μL文庫，在 Agilent Bioanalyzer 機器上用 Agilent High Sensitivity DNA Kit 對文庫做 2100 質檢。利用Quant?iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Promega QuantiFluor 上對文庫進行定量，合格的文庫計算后濃度應在 2 nmol／L 以上。（2） 測序。對合格的文庫，在MiSeq 機器上利用 MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）進行2×300 bp 的雙端測序。上述文庫量的多少可根據(jù)實際情況控制為15～18 pmol／L。

1.3 分析方法

1.3.1 原始測序數(shù)據(jù)的篩選及質量控制 使用FASTQ 格式對測序原始數(shù)據(jù)保存。對通過質量初篩的雙端序列使用FLASH 軟件根據(jù)重疊堿基進一步配對連接。最后，根據(jù)每個樣本對應的Index 信息，獲得每個樣本的有效序列。

1.3.2 可操作分類單元分析（OTU）劃分和分類鑒定 通過OTU 對原始數(shù)據(jù)進行質控后，用QIIME軟件，按97%的序列相似度進行歸并和OTU 劃分，并選取每個OTU 中具有最高豐度的序列作為OTU的代表序列。各樣本（組）共有OUT 的數(shù)量運用R軟件計算統(tǒng)計，各樣本（組）所共有和獨有的OUT所占的比例通過Venn 圖直觀地呈現(xiàn)出來。

1.3.3 α 多樣性分析 獲得OUT 豐度矩陣之后，可以通過分析體現(xiàn)群落豐富度Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)，以及體現(xiàn)群落均勻度的 Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，計算每個樣本群落的多樣性，即Alpha 多樣性。其中，Chao1 或 ACE 指數(shù)越大，即群落的豐富度越高。Shannon 或 Simpson 指數(shù)值越高，即群落多樣性越高。

1.3.4 分類學組成分析 采用QIIME 軟件，獲得每個樣品在在門和屬分類水平上的組成和豐度分布表，并通過柱狀圖呈現(xiàn)分析結果。

1.3.5 組間分類學組成的差異分析 根據(jù)每個樣本在各分類學水平的組成和序列分布，對兩個或多個樣本間的豐度差異進行比較，并用統(tǒng)計檢驗評價是否具有顯著性差異。使用Mothur 軟件和Metastats 的統(tǒng)計學算法，對門和屬水平的各個分類單元在樣本間的絕對豐度的差異進行統(tǒng)計學分析比較。

2 結 果

2.1 OUT聚類

以97%相似度的標準聚類，得到3 224 個OUT，其中球部與末端回腸標本獨有的的數(shù)目分別為595、566，2 種標本共有的 OUT 數(shù)目為 2 063 個，見圖1。

圖1 Venn 圖Fig.1 Venn diagram

2.2 腸道黏膜菌群α多樣性分析

使用QIME 軟件，OTU 豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣，并繪制繪制稀疏曲線。橫坐標表示每個樣本中隨機抽取的序列的總數(shù)；縱坐標表示在相應深度下觀測到的OTU 數(shù)。曲線的長短反映了樣本測序的數(shù)量，曲線越長，測序深度越高，觀測到更高多樣性的可能性更大。曲線的平緩反映了測序深度對于樣品多樣性的影響，曲線越平緩，說明測序結果已能足夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到的尚未發(fā)現(xiàn)的大量新OTU，α 多樣性分析各指數(shù)值見表1，稀疏曲線圖見圖2，本實驗結果表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性。

表1 球部和末端回腸黏膜菌群α 多樣性Tab.1 Alpha diversity statistical analysis of the intestinal microbiome

圖2 α 多樣性分析稀疏曲線圖Fig.2 Rarefaction curves of alpha diversity statistical analysis

2.3 球部黏膜黏膜菌群結構

對所有OTU 進行物種歸類，球部黏膜菌群測得個28 個門，397 個屬。末端回腸黏膜測得25 個門，344 個屬。兩個部位在門水平上均以梭桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門（Fusobacteria，Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Actinoba?cteria）為主要菌群，但所占比例不同，球部優(yōu)勢菌群所占比例依次為 49.43%、25.93%、8.68%、5.19%、5.76%；末端回腸優(yōu)勢菌群所占比例依次為38.30%、29.61%、17.56%、8.15%、3.70%。屬水平球部黏膜以鯨甘菌屬、氣單胞菌屬、貪銅菌屬、不動桿菌屬、梭菌屬 （Cetobacterium，Aeromonadaceae，Cupriavidus，Acinetobacter，Clostridium）為主要菌群，所占比例依次為 49.38%、6.42%、5.62%、4.78%、3.84%；末端回腸黏膜以鯨甘菌屬、貪銅菌屬、氣單胞菌屬、擬桿菌屬、不動桿菌屬（Cetobacterium，Cupriavidus，Aero?monadaceae，Bacteroides，Acinetobacter） 為主要菌群，所占比例依次為 37.56、12.83%、4.2%、3.84%、2.74%（表2～3）。所有檢測樣本在門（圖3）和屬（圖4）水平以柱狀圖表示。

2.4 兩組間分類組成的差異分析

運用Metastats 的統(tǒng)計學方法對門和屬水平的各個分類單元在兩組之間的序列量差異進行兩兩比較。在門和屬水平各發(fā)現(xiàn)有顯著差異的分類單元個數(shù)各為18、101 個。在門水平和屬水平最有顯著差異的前20 個分類單元間（圖5 ～6）。以小提琴圖結合箱線圖的形式表達出來：小提琴圖可以直觀地顯示數(shù)據(jù)的分布特征，其中，“小提琴”的寬度越寬，表明該序列量下對應的樣本越多；箱線圖邊框表示四分位數(shù)間距（IQR），水平線代表中位值，上下觸須分別代表1.5 倍IQR 范圍，符號“?”表示超過范圍的極端值。

表2 球部和末端回腸黏膜優(yōu)勢菌群在門水平上的分布（＞1%）Tab.2 The abundance of known bacterial species at the phylum level （＞1%）

表3 球部和末端回腸黏膜優(yōu)勢菌群在屬水平上的分布（＞1%）Tab.3 The abundance of known bacterial species at the genus level （＞1%）

圖3 兩組間門水平菌群組成柱狀圖Fig.3 Bar graph showing the phylum level compositions of the bacterial communities

圖4 兩組間門水平菌群組成柱狀圖Fig.4 Bar graph showing the genus level compositions of the bacterial communities

圖5 兩組間差異最顯著的前20 個分類單元的豐度分布圖（門水平）Fig.5 The abundance distributions of the top 20 taxa with the most significant differences between the two groups were visualized with violin plots（phylum level）

圖6 兩組間差異最顯著的前20 個分類單元的豐度分布圖（屬水平）Fig.6 The abundance distributions of the top 20 taxa with the most significant differences between the two groups were visualized with violin plots（genus level）

2.5 球部正常黏膜與炎癥狀態(tài)菌群組成差異

進一步檢測了8 對球部正常黏膜與炎癥狀態(tài)下黏膜菌群，結果顯示：在門水平上，正常黏膜以Fusoba?cteria和Proteobacteria為優(yōu)勢菌群，所占比例分別為58.4%，16.1%；在炎癥狀態(tài)下，兩種優(yōu)勢菌群的比例依次為43.7%，34.2%。兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在屬水平上，正常黏膜以Cetobacterium，Aeromona?daceae，Clostridium（比例分別為 58.4%、8.5%、4.8%）為主，炎癥狀態(tài)黏膜以Cetobacterium，Cupriavidus，Helicobacter（比例分別為43.6%、13.1%、4.5%）為主（表4）。

表4 球部正常黏膜和炎癥狀態(tài)下菌群門水平的分布情況（＞1%）Tab.4 The abundance of known bacterial spicies at the phylum level in the normal and inflammation state of duodenal bulb（＞1%）

2.6 末端回腸正常黏膜與炎癥狀態(tài)菌群組成差異

進一步檢測了15 對末端回腸正常黏膜與炎癥狀態(tài)下黏膜菌群，結果顯示：在門水平上，正常黏膜以Fusobacteria和Proteobacteria為優(yōu)勢菌群，所占比例分別為38.3%、29.61%；在炎癥狀態(tài)下，兩種優(yōu)勢菌群的比例依次為36.86%、40.04%。但兩組差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在屬水平上，正常黏膜以Cetobacterium，Cupriavidus，Enterobacteriaceae（分別為37.56%、12.83%、4.2%）為主，炎癥狀態(tài)黏膜仍以Cetobacterium，Cupriavidus，F(xiàn)aecalibacterium（分別為36.38%、16.53%、6.01%）為主（表5）。

表5 末端回腸正常黏膜和炎癥狀態(tài)下菌群門水平的分布情況（＞1%）Tab.5 The abundance of known bacterial spicies at the phylum level in the normal and inflammation state of terminal ileum（＞1%）

3 討 論

活檢樣本是目前人類研究黏膜菌群的金標準，小腸菌群的研究仍有較多的局限性，尤其是在選擇有代表性的人體標本和應用可靠的分析方法方面。一些研究發(fā)現(xiàn)，在較高的分類學水平上，黏膜微生物成分沿腸道趨向于更穩(wěn)定［4?5］。雖然糞便菌群是結腸黏膜菌群的代表，但活體組織檢查是研究小腸黏膜菌群的最佳方法，內鏡活檢標本、抽吸標本、黏膜刷標本、十二指腸上段和回腸遠端手術標本均可用于菌群分析［6］。

在腸道穩(wěn)態(tài)情況下，本研究在門和屬的水平上鑒定出了球部和回腸末端的菌群組成及多樣性。從結果可以看出，小腸十二指腸球部和回腸末端在門水平上以Fusobacteria，Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria為主要菌群，這與先前腸道菌群研究結果相一致［7?8］。說明腸道菌群中優(yōu)勢菌群的組成基本一致。但是兩個部位不同優(yōu)勢菌群所占比例不同，在門和屬水平對比中，兩組間最具顯著差異包括18 個門和101 個屬，說明在正常狀態(tài)下，不同部位的腸道黏膜菌群組成是有差異的。提示著腸道不同部位在免疫、代謝、能量吸收等方面發(fā)揮不同功能，具體功能的探討需要進一步深入研究。此外，不同個體同一部位腸道菌群的組成和多樣性也存在一定的差異性。

在臨床上，小腸非特異性炎癥的發(fā)病率較高，具體病因與發(fā)病機制不十分明確。不同部位的黏膜炎癥狀態(tài)下，其黏膜的菌群可能存在一定的變化，因此進一步對不同部位黏膜炎癥狀態(tài)的菌群測序，對于探討不同部位小腸非特異性炎癥的病因、發(fā)病機制以及指導不同益生菌制劑的治療或微生物的移植治療等方面，具有有一定的臨床意義和臨床治療指導價值。在黏膜炎癥狀態(tài)下，尤其是球炎中，菌群組成比例存在一定改變，其中一個明顯的差異是機會致病菌Proteobacteria的豐度增加，F(xiàn)irmicutes和Bacteroides菌門比例下降，此外，炎癥患者中乳酸菌群比例也有下降，這與之前炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）中的研究一致發(fā)現(xiàn)，Proteobacteria屬于革蘭陰性菌，包含多種致病菌屬，提示了腸道菌群的失調參與了炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展［9?10］；同時也提示了在臨床上，有針對性的補充相應的益生菌制劑或微生物移植等可能對十二指腸球部炎癥有一定的治療價值。但是末端回腸炎沒有顯示出顯著的菌群差異，僅存在部分菌群的輕微改變，提示部分菌群的改變參與腸炎的發(fā)生；有針對性的補充相應的益生菌制劑或微生物移植等可能對末端回腸炎癥也具有一定的治療指導價值。當然，由于實驗的局限，這部分的結果可能還受到以下方面的影響。一方面，腸鏡前需要服用瀉藥清腸，這個過程對腸道菌群必然存在一定影響，下一步的研究方案需要開發(fā)精確的取樣器械，以求解決采樣時可能出現(xiàn)的誤差；另一方面，本課題納入樣本量較少，還需要進一步擴大樣本量來驗證等。

已知所研究的菌群中，Actinobacteria 中所含的菌屬能夠參與發(fā)酵碳水化合物并產生甲酸、乳酸鹽等，并與體重指數(shù)呈負相關［11］；Firmicutes中所含菌屬能清除腸道中的氣體，因其能將腸道中的氣體轉化成乙酸［12］。Bacteroidetes是一種厭氧且對膽汁耐受的革蘭陰性菌，對促進相關淋巴組織和免疫前抗體的形成具有重要意義［13］；研究表明，腸道Bacteroidetes可以通過調節(jié)多種宿主基因的表達，包括參與營養(yǎng)吸收、強化黏膜屏障和血管生成因子的表達，直接調節(jié)腸道功能［14?15］。在關于乳頭狀甲狀腺癌術后功能減低的患者腸道細菌變化的研究中顯示Bacterodietes出現(xiàn)顯著性下降［16］。另外有研究顯示Bacteroidetes中的某些特定的種屬對預防Clostridium difficile感染起著重要作用［17］。因此Bacteroidetes平衡對腸道穩(wěn)態(tài)至關重要。Actinobacteria中的Acinetobacter包含一組嚴格需氧的物種，如A．baumannii，與醫(yī)院感染有關［18］。

截至目前，小腸功能及小腸腸道菌群研究尚少，但重視小腸腸道菌群與疾病相關性研究，且開發(fā)能夠準確反映腸道環(huán)境的具有代表性的微創(chuàng)微生物采養(yǎng)工具是非常必要的。探索正常黏膜狀態(tài)的菌群組成，對于炎癥和其他疾病狀態(tài)如IBD，腫瘤等微生物變化可能提供參考療法，如益生菌療法、關注飲食、微生物移植等。