陳友銘，陳媛媛，陳宇涵，楊振偉，周 蕾，王岳鵬

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200092；2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院急診科，安徽蕪湖 241001；3.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心胸外科，上海 200065）

心肌肥厚是心室肌對(duì)壓力負(fù)荷增加以及神經(jīng)體液生長(zhǎng)激素分泌過(guò)多的一種代償性反應(yīng)。持續(xù)性的心肌肥大會(huì)導(dǎo)致心功能逐步失代償，并惡化為心力衰竭［1?2］。血管緊張素（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ） 是觸發(fā)體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin?angiotensin?aldosterone system，RAAS）的最重要激素［3］。AngⅡ通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)小 G 蛋白 Ras 家族，繼而激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs），促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。小 G蛋白家族中Rac1 是Ras 家族中的主要成員之一，前期研究表明它在心肌肥厚中起著重要作用，但是具體機(jī)制還不明確。細(xì)胞內(nèi)Rac1 的活性受到嚴(yán)密的信號(hào)調(diào)節(jié)，在與GDP 結(jié)合的失活狀態(tài)及與GTP 結(jié)合的激活狀態(tài)之間循環(huán)往復(fù)。在AngⅡ刺激下，心肌細(xì)胞Rac1 活性增高，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大［4］。為了避免在 Rac1 的激活與失活的復(fù)雜調(diào)節(jié)中研究 Rac1 的功能，可以用 Rac1?V12 這種具有持久活性的Rac1 人工突變體來(lái)模擬持續(xù)的Rac1 激活狀態(tài)。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞超表達(dá)Rac1?V12，引起細(xì)胞肌絲增粗、肥厚相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)［5］。

FGF13 是電壓門(mén)控Na＋通道輔助亞基，前期研究證實(shí)，F(xiàn)GF13 促進(jìn)壓力負(fù)荷引起心肌肥厚［6］。為了探討AngⅡ通過(guò)激活小G 蛋白R(shí)ac1 促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制，本研究使用芯片技術(shù)篩選出FGF13。通過(guò)阻斷小G 蛋白 Rac1 活性和降低FGF13 的表達(dá)，證明FGF13 在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚中發(fā)揮重要作用，從而為臨床防治心肌肥厚提供有效的分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Ad?Vector、Ad?Rac1、Ad?Rac1?V12 等腺病毒表達(dá)載體購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó) Worthington Biochemica 公司；GAPDH 兔多克隆抗體、Anp 兔多克隆抗體、β?Mhc兔多克隆抗體、Rac1 兔多克隆抗體、FGF13 兔多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)ABclonal 公司；Flag 鼠單克隆抗體、山羊抗兔二抗、SDS?PAGE 凝膠試劑盒、SDS?PAGE 蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 原代心肌細(xì)胞的分離和藥物處理

取出生2～3 d 的SD 大鼠心臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，剪碎，用含0.25%胰蛋白酶的D?Hanks 鹽溶液4 ℃消化16 h 后，用Ⅱ型膠原酶（100 U／mL）在 37 ℃水浴鍋消化30 ～40 min，直至形成單細(xì)胞懸液。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h 后去除成纖維細(xì)胞，細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)皿中，加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷使其終濃度為0.1 mmol／L。該方法心肌細(xì)胞純度可達(dá)90%。心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，105U／L 青霉素，100 mg／L 鏈霉素的 DMEM 的低糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后換成無(wú)糖培養(yǎng)基，并分3 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：生理鹽水刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）刺激48 h；AngⅡ（1 μmol／L）和 Rac1 特異性抑制劑 NSC?23766（50 μmol／L）同時(shí)刺激 48 h。

1.3 小干擾RNA的合成及轉(zhuǎn)染

siRNA 由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表1。siRNA 轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞：將原代心肌細(xì)胞鋪至6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%時(shí)，參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，使用Lipofe?ctamineTM2000 將siRNA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞。將被轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞分為 FGF13?si1 組、FGF13?si2 組、FGF13?si3組及陰性對(duì)照組NC?siRNA，并在轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)基。

表1 小干擾RNA 序列Tab.1 The sequence of small interference RNA

1.4 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組

（1） 空白對(duì)照組：轉(zhuǎn)染帶GFP 熒光蛋白的空載病毒12 h，換成DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；（2） Rac1 組：轉(zhuǎn)染 Rac1 病毒 12 h，換成 DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；（3） Rac1?V12 組：轉(zhuǎn)染Rac1?V12 病毒 12 h，換成 DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；（4） Rac1?V12＋FGF13?si3 組：轉(zhuǎn)染 Rac1?V12 病毒12 h，換成DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)同時(shí)加入小干擾FGF13?si3 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 激光共聚焦進(jìn)行心肌細(xì)胞的鑒定及心肌細(xì)胞表面積的檢測(cè)

心肌細(xì)胞以5×103／孔接種24 孔板中，分組處理后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛固定15 min，0.3%Tritonx?100 室溫通透 20 min，PBS 漂洗3 遍，用含5%驢血清的 PBS 室溫封閉1 h，一抗孵育（α?actinin，1 ∶300）過(guò)夜，室溫二抗［山羊抗兔IgG（H＋L）二抗 Cy3，1 ∶500］孵育 1 h，DAPI（1 ∶1 000）孵育10 min。細(xì)胞圖像采用 LSM510 共聚焦顯微鏡拍攝。每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組各取3 孔細(xì)胞進(jìn)行處理，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。每孔細(xì)胞樣品隨機(jī)獲取10 個(gè)不同視野的圖片，每個(gè)圖片取2 ～5 個(gè)細(xì)胞，并通過(guò)Image?J 軟件測(cè)定3 次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞表面積，并計(jì)算其相對(duì)平均表面積［7］。

1.6 GST pull down實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用 PBS 洗滌 3 次。加入1 mL 裂解緩沖液（裂解液配方：50 mmol／L Tris?HCl，pH＝7.5，1%NP?40，100 mmol／L NaCl，10%甘油，10 mmol／L MgCl 和蛋白酶抑制劑混合物），置于在冰上，40 min 后離心（離心半徑 10 cm，12 000 r／min，10 min，4 ℃）。吸取上清液，取 100 μL 于另一 EP 管并加入蛋白上樣緩沖液。剩余的裂解物加入20 μg GST?PAK?CRIB 結(jié)構(gòu)域（PAK?CD）孵育 1 h（GST?PAK?CRIB 融合蛋白已偶聯(lián)到谷胱甘肽瓊脂糖珠）。用漂洗緩沖液漂洗沉淀復(fù)合物3 遍，離心（離心半徑10 cm，5 000 r／min，5 min，4 ℃）去除漂洗液并加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸 10 min。

1.7 Western印跡法

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用PBS 洗滌3 次。加入強(qiáng)RIPA 裂解液，置冰上30 min，然后轉(zhuǎn)移至新的 EP管中離心10 min。取上清液，用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白，按比例加入蛋白上樣緩沖液95 ℃煮沸 10 min。取 20 μg 蛋白進(jìn)行 SDS?PAGE 電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 二抗（1 ∶1 000）室溫?fù)u床1 h，繼續(xù)TBST 洗膜3 次，用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR

采用 TRIzol 試劑提取細(xì)胞的總 RNA，Primer?Script 一步法 RT?PCR 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。利用SYBR Premix Dimmer Erase 試劑盒通過(guò) qRT?PCR 擴(kuò)增 cDNA。每個(gè)樣本的基因表達(dá)用內(nèi)參GAPDH 均一化。引物購(gòu)自生物工程（上海）股份有限公司，見(jiàn)表2。以 2-ΔΔCt表示目的基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 基因微陣列分析

將 Ad?Vector、Ad?Rac1、Ad?Rac1?V12 共 3 種腺病毒轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞。制備總 RNA，反轉(zhuǎn)錄，cDNA 標(biāo)記，雜交，圖像采集和分析由中國(guó)上海歐易生物公司進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，是將cDNA 與熒光染料偶聯(lián)并在4 次重復(fù)中與Prime View TM 人類基因表達(dá)陣列（Affymetrix，USA）雜交。使用 GeneSrping軟件（版本 12.5；Agilent Technologies）的分位數(shù)算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。通過(guò)倍數(shù)變化（上調(diào)≥2.0，下調(diào)≤-2.0）以及P≤0.05 鑒定DEG。

表2 聚合酶鏈反應(yīng)序列Tab.2 The sequence of polymerase chain reaction

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布，計(jì)量資料采用±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組連續(xù)性變量比較采用Pearson 相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片結(jié)果分析

構(gòu)建 Ad?Vector、Ad?Rac1、Ad?Rac1?V12 腺病毒并轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，收集樣本后驗(yàn)證3 種病毒轉(zhuǎn)染效率。Ad?Rac1 組和 Ad?Rac1?V12 組均成功表達(dá)內(nèi)源性和外源性Rac1 蛋白，見(jiàn)圖1A。將HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rac1 腺病毒 3 組（Rac1?1、Rac1?2、Rac1?3） 和 轉(zhuǎn)染Rac1?V12 腺病毒 3 組（V12?1、V12?2、V12?3）。采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，篩選組間差異表達(dá)基因，篩選條件為L(zhǎng)og2Fold change≥2.0，P＜0.05。基因芯片結(jié)果表明 Ad?Rac1?V12 組有 402 個(gè)相對(duì)于 Ad?Rac1 組的差異基因，其中 FGF13 上調(diào)（28±1.2）倍，見(jiàn)圖1B。qRT?PCR 結(jié)果顯示，與 Ad?Rac1 組相比，Ad?Rac1?V12 組FGF13 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2.2 持續(xù)活化的Rac1促進(jìn)心肌細(xì)胞FGF13的表達(dá)

為進(jìn)一步探究被激活的 Rac1 與心肌細(xì)胞FGF13 表達(dá)量之間的關(guān)系，將心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Ad?Vector、Ad?Rac1、Ad?Rac1?V12 腺病毒 48 h，觀察3 種腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的效率，見(jiàn)圖2A。Ad?Rac1 組和 Ad?Rac1?V12 組均成功表達(dá)外源性 Rac1蛋白，見(jiàn)圖2B。GST pull down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ad?Rac1 組相比，Ad?Rac1?V12 組 Active Rac1 的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），表明 Ad?Rac1?V12 引起Rac1 持續(xù)性激活，見(jiàn)圖2B。與 Ad?Rac1 組相比，Ad?Rac1?V12 組 FGF13 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，心肌肥大標(biāo)志基因 Anp、β?Mhc 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2C、2D。

圖1 過(guò)表達(dá)Rac1 和Rac1?V12 的差異表達(dá)基因Fig.1 Difference of gene expression between overexpression of Rac1 and Rac1?V12

2.3 下調(diào)FGF13減輕Rac1?V12介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

為進(jìn)一步探究被激活的Rac1 調(diào)控FGF13 參與心肌細(xì)胞肥大的作用，構(gòu)建 FGF13?siRNA 抑制FGF13 的表達(dá)（小干擾序列已在材料與方法中說(shuō)明）。Western 印跡法檢測(cè)3 組小干擾試劑的敲減效率，結(jié)果表明FGF13?si3 組的敲減效率最高（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、3B。因此，以下實(shí)驗(yàn)選擇小干擾FGF13?si3 進(jìn)行相關(guān)研究。與 Ad?Vector 組、 Ad?Rac1 組相比，Ad?Rac1?V12 組 Anp、β?Mhc 表達(dá)顯著增高、心肌細(xì)胞表面積增大（P＜0.05）。而與Ad?Rac1?V12 組相比，Rac1?V12＋FGF13?si3 組 Anp、β?Mhc 表達(dá)降低、心肌細(xì)胞表面積減?。≒＜0.05），表明下調(diào) FGF13 減輕 Rac1?V12 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，見(jiàn)圖3C～3F。

圖2 過(guò)表達(dá) Rac1?V12 對(duì)心肌細(xì)胞 FGF13 的表達(dá)量及肥大基因的影響Fig.2 Effects of overexpression of Rac1?V12 on the expression of FGF13 and the hypertrophic gene in cardiomyocytes

圖3 下調(diào)FGF13 減輕Rac1?V12 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大Fig.3 Down?regulation of FGF13 reduced Rac1?V12?induced cardiomyocyte hypertrophy

2.4 Ang Ⅱ通過(guò)激活Rac1上調(diào)FGF13表達(dá)

研究表明，Ang Ⅱ刺激下，Rac1 活性增強(qiáng)并促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大［3］。為探究 Ang Ⅱ激活 Rac1 與FGF13 之間的關(guān)系，將分離的乳鼠心肌細(xì)胞分3 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：生理鹽水刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）和 Rac1 特異性抑制劑 NSC23766（50 μmol／L）同時(shí)刺激 48 h。與對(duì)照組（生理鹽水）相比，單獨(dú)給予Ang Ⅱ刺激，心肌細(xì)胞表面積增大，Anp、β?Mhc、Active Rac1、FGF13 表達(dá)升高，與 Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ＋NSC23766 組心肌細(xì)胞表面積減少，Anp、β?Mhc、Active Rac1、FGF13 表達(dá)下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 Ang Ⅱ通過(guò)激活Rac1 繼而促進(jìn)FGF13 的表達(dá)Fig.4 Ang Ⅱ promoted the expression of FGF13 though activating Rac1

3 討 論

病理性心肌肥厚是心源性猝死的重要且獨(dú)立的危險(xiǎn)因子［8?9］。因此，研究其潛在發(fā)生機(jī)制對(duì)尋找心肌肥厚的治療靶點(diǎn)有著重要意義。Rac1 是小G 蛋白R(shí)ho 亞家族的成員之一，小G 蛋白與心肌肥厚密切相關(guān)［10?11］。生理狀態(tài)下，Rac1 參與基因轉(zhuǎn)錄與周期調(diào)節(jié)等相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)，這一過(guò)程受到嚴(yán)密調(diào)控，因此靜息時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi) Rac1 的活性水平低［12?13］。病理狀態(tài)下，Rac1 活性顯著增高，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與活性氧自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生［14］。為了避開(kāi)Rac1 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜調(diào)節(jié)，一般使用Rac1?V12 這種具有持久活性的人工突變體來(lái)代表激活的Rac1。心臟特異性超表達(dá)Rac1?V12 的轉(zhuǎn)基因小鼠出生后即表現(xiàn)為嚴(yán)重的心肌肥厚癥狀，繼而心功能迅速失代償，直至發(fā)展為充血性心力衰竭［15］。在他莫西芬誘導(dǎo)的心臟特異性Rac1 基因敲除小鼠中，因?yàn)镽ac1 基因的缺失能夠顯著減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心室肥厚［16］。盡管在 AngⅡ刺激后 Rac1 被激活，但其下游促進(jìn)心室肥厚的信號(hào)通路有很多，仍然有諸多機(jī)制不清楚。因此研究活性Rac1 促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制并尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)具有重要意義。

表達(dá)譜芯片為尋找潛在的機(jī)制提供可能。為了進(jìn)一步探究Rac1 被激活后導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制，本研究成功構(gòu)建了Rac1 人工突變體Rac1?V12腺病毒載體來(lái)模擬病理狀態(tài)下Rac1 的持續(xù)激活狀態(tài)，這比直接使用能夠?qū)е滦募》屎竦闹T多刺激劑更為敏感及準(zhǔn)確。通過(guò)基因芯片篩選工具細(xì)胞HEK293T 超表達(dá) Rac1?V12 后上調(diào)的基因，發(fā)現(xiàn)FGF13 表達(dá)明顯增高。研究證實(shí)，敲除FGF13 有利于減輕壓力負(fù)荷增加介導(dǎo)的心室肥厚［6］。

本研究中，在體外實(shí)驗(yàn)中將 Ad?Rac1 和 Ad?Rac1?V12 轉(zhuǎn)染原代大鼠心肌細(xì)胞。相較與 Ad?Rac1 組，Ad?Rac1?V12 組 FGF13 表達(dá)顯著上調(diào)，這與HEK293T 細(xì)胞超表達(dá) Rac1?V12 慢病毒得出的基因芯片結(jié)果一致。因此推測(cè)Rac1 的激活導(dǎo)致下游FGF13 的上調(diào)是一種普遍存在的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。而在心肌細(xì)胞中FGF13 的上調(diào)可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，而非分泌到細(xì)胞外通過(guò)作用與自身的自分泌以及作用于邊上心肌細(xì)胞的旁分泌的方式，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。本研究進(jìn)一步通過(guò)Ang Ⅱ刺激心肌細(xì)胞增強(qiáng)Rac1 活性，發(fā)現(xiàn) FGF13 表達(dá)量升高。AngⅡ刺激的同時(shí)使用 NSC23766 抑制 Rac1 活性，F(xiàn)GF13 表達(dá)下調(diào)。為進(jìn)一步探究FGF13 的作用機(jī)制，體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染Rac1?V12 病毒的同時(shí)加入siRNA下調(diào)FGF13，結(jié)果顯示與超表達(dá)Rac1?V12 組相比，Rac1?V12＋FGF13?Si3 組 ANP、β?MHC 表達(dá)降低、心肌細(xì)胞面積減小。這些結(jié)果表明下調(diào)FGF13 可減輕Rac1 激活所引起的心肌細(xì)胞肥大。

綜上，本研究闡述了Ang Ⅱ通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Rac1，繼而上調(diào)FGF13，從而致心肌細(xì)胞肥大。本研究進(jìn)一步完善了Ang Ⅱ通過(guò)激活Rac1 促進(jìn)心肌肥大的機(jī)制，為臨床防治心肌肥厚提供新的分子靶標(biāo)。接下來(lái)，對(duì)激活的Rac1 是如何導(dǎo)致FGF13 上調(diào)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。