時 偉，付格紅，張 凱，吳德光*

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司，陜西 西安 710100；3.陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，陜西 西安 711400）

火棘果（Pyracantha fortuneana）又名火把果等，蘋果亞科火棘屬，據(jù)報道含有7種人體必需氨基酸和2種嬰幼兒必需氨基酸[1-2]，此外，還含有豐富的黃酮類物質(zhì)、多酚、槲皮素等，具有提高免疫力、清除自由基、抗疲勞、抗腫瘤等功效[3-4]，主要分布于我國東南、西南和西北部地區(qū)，其中貴州省在黔南獨山縣、銅仁、畢節(jié)地區(qū)有大量分布[5]。枸杞（Lycium chinensis）又名枸杞子等，茄科枸杞屬，富含枸杞多糖、維生素C（vitamin C，VC）、亞油酸等多種活性成分[6-7]，是我國傳統(tǒng)的藥食同源佳品。藥用種類主要為寧夏枸杞[8]，具有良好的生理功效，可增強人體免疫能力，緩解腰肌酸痛和頭昏耳鳴等，主要分布于我國西北地區(qū)[9]。杜琨[10]利用單一酵母菌株發(fā)酵研究了金櫻子與火棘果復合制作保健果酒，產(chǎn)品具有獨特的金櫻子火棘果香；蔣春蘭等[11]的研究表明，火棘果酒的抗氧化作用非常強，對2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基的清除作用明顯；聶中良等[12]研究了昆明地區(qū)野生火棘果釀酒工藝，其最佳發(fā)酵條件為初始糖度16%，初始pH值為7.0，發(fā)酵溫度27 ℃，酵母添加量0.7%，酒體呈亮紅色，具有火棘果果酒的獨特風格；李秀秀等[13]研究了枸杞與石榴發(fā)酵釀酒工藝，其最佳發(fā)酵條件為石榴枸杞果汁體積比2∶1，酵母接種量3%，發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵溫度28 ℃，酒體香純厚，透明度高；王玉良等[14]研究了黃精枸杞酒的成分，結果顯示黃精枸杞酒中富含大量的總皂苷、多糖和微量的黃酮類化合物。目前主要使用單一菌株和單一原料進行發(fā)酵釀造，利用枸杞復合其他原料釀酒已有報道，其釀酒工藝研究也越來越深入。

本試驗以產(chǎn)自貴州畢節(jié)地區(qū)的野生火棘鮮果和寧夏枸杞干果為原料，利用本實驗室保藏的兩株性能良好的酵母菌株，采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，研發(fā)了一款具有良好保健功效的果酒產(chǎn)品，旨在探索貴州地區(qū)野生火棘果資源的深加工技術，以期帶動當?shù)亟?jīng)濟產(chǎn)業(yè)結構升級，助力國家精準扶貧工程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生火棘果：采自貴州畢節(jié)地區(qū)，選用飽滿完整無缺的新鮮火棘果，置于低溫冰箱中備用；枸杞干果：選購自寧夏產(chǎn)區(qū)；產(chǎn)酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1：本實驗室篩選保藏；偏重亞硫酸（分析純）：天津化學試劑三廠；檸檬酸（分析純）：河南萬恒生物科技有限公司；果膠酶（酶活3.0×104U/g）：河南樂泰食品有限公司；白砂糖：市售。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸膏10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10 g/L，pH6.0，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

FA2104N電子分析天平：上海雙旭電子有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：常州市金壇華偉儀器廠；PLZ-1.5型榨汁機：江蘇海鷗食品機械制造公司；BKQ-B100II高壓蒸汽滅菌鍋：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；PAL-1糖度儀：河北潤聯(lián)科技有限公司；LRH-500F生化培養(yǎng)箱：北京佳源興業(yè)科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟南東儀實驗室設備有限公司；PHS-3C pH計：杭州奧利龍儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點[15-17]

將新采摘的火棘果進行流水沖洗，破碎壓榨過程中注意避免果籽破碎，加入適量偏重亞硫酸鉀防止果汁發(fā)生氧化褐變。將枸杞干果以1∶5（g∶g）的比例加入90～95 ℃熱水中浸泡4 h，待充分吸水泡開后進行打漿處理，后與火棘果果汁混合。

果膠酶酶解：火棘果和枸杞中均含有果膠，前處理使用果膠酶酶解，可以加速出汁和促進澄清，同時減少原酒中因果膠發(fā)酵分解而帶來的雜味?；旌瞎刑砑?5 mg/L果膠酶，并在25 ℃條件下酶解1.5 h。

硫處理：果酒發(fā)酵在預處理階段，通常要添加偏重亞硫酸鉀溶液，果汁中含有一定濃度的SO2，可以達到殺菌、抗氧化、增酸、單寧物質(zhì)溶出、使果酒整體風味向好的作用?；旌瞎蠸O2添加量為70 mg/L。

成分調(diào)整：由于混合汁的糖度相對較低，為保證發(fā)酵成品果酒酒精度，通常要用白砂糖調(diào)整混合汁的糖度使其達到21%，同時用檸檬酸調(diào)整初始發(fā)酵pH值，保證發(fā)酵過程較好啟動。

菌株活化：將實驗室斜面保藏的兩株菌分別經(jīng)過在YEPD培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上逐級接種，同時都在28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h進行逐級傳代培養(yǎng)。

主發(fā)酵：將兩株酵母菌按比例混合培養(yǎng)后接種至混合汁中，控制初始發(fā)酵糖度為21%，注意保持恒溫發(fā)酵，攪拌頻率為1 次/d。

后發(fā)酵：由于果渣及酵母發(fā)生沉淀，這時候可以進行倒罐發(fā)酵30 d。

陳釀：新酒一般比較粗糙，將其放在陰涼避光處，通過一定時間貯存可以使酒體變得協(xié)調(diào)。

膜分離：灌裝前使用過濾膜處理酒體，可以使酒體更加澄清，穩(wěn)定性更好。

消毒、灌裝：灌裝后使用巴氏消毒得野生火棘果保健酒。

1.3.2 野生火棘果保健果酒工藝優(yōu)化單因素試驗

接種量的確定：以混合果汁體積的5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%分別進行接種，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評分為考察指標，分析接種量對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

接種比例的確定：以產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母接種比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（V/V）分別進行接種，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評分為考察指標，分析接種比例對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

初始pH值的確定：用檸檬酸將發(fā)酵液初始pH值分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，于24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評分為考察指標，分析初始pH值對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

發(fā)酵溫度的確定：分別于發(fā)酵溫度為18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的條件下恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.1%以下，以感官評分為考察指標，分析發(fā)酵溫度對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

發(fā)酵時間的確定：分別將主發(fā)酵時間設為6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d，保持恒溫發(fā)酵，以感官評分為考察指標，分析發(fā)酵時間對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 野生火棘果保健果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗設計原理，選取接種量（A）、初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）4 個因素為自變量，以野生火棘果保健果酒的感官評分（Y）為響應值，采用響應面法對野生火棘果保健果酒的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，最后對優(yōu)化條件進行驗證試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for wine fermentation technology optimization

1.3.4 分析檢測

（1）感官評定

邀請6位果酒品評師，從酒體外觀、香氣、沉淀、口感四個方面對野生火棘果保健果酒進行感官評定，取平均值為每款酒最終感官評分[18]，滿分100分。野生火棘果保健酒的感官評分標準見表2。

表2 野生火棘果保健果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of wild Pyracantha fortuneana health wine

（2）理化指標

酒精度測定采用酒精計法；殘?zhí)橇繀⒄諊鴺薌B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定[18]。

（3）微生物指標

參照GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定》[19]、GB 4789.3—2016《大腸菌數(shù)測定》[20]、GB 4789.4—2016《沙門氏菌檢驗》[21]及GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗》[22]。

2 結果與分析

2.1 野生火棘果保健果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 接種量對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖1可知，酵母菌接種量在5%～11%時，野生火棘果保健果酒的感官評分隨著接種量的增加呈現(xiàn)先快速上升后緩慢下降的趨勢。當接種量為9%時感官評分達到最高，為92分。原因可能是酵母菌接種量的變化，可以影響發(fā)酵的啟動速率，從而影響酵母菌代謝產(chǎn)物和自身消解體在酒體中的含量。當接種過量時可能會導致酒體產(chǎn)生不良的酵母味；當接種量不足時，又會使得酒體單薄、香氣不足而影響感官評分；接種量適宜時可以使得芳香類物質(zhì)增多、酒體飽滿平衡，從而提高酒體品質(zhì)。因此，選擇最佳酵母菌接種量為9%。

圖1 接種量對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of inoculum on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.2 酵母菌接種比例對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著兩株酵母菌接種比例的變化，野生火棘果保健果酒的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母為1∶4（V/V）時，感官評分最高，為87分。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是混菌比例不同導致發(fā)酵過程中兩株菌在發(fā)酵液中的數(shù)量也不盡相同，從而影響酒體中代謝產(chǎn)物積累，最終影響酒體的感官評分。因此，選擇最佳接種比例為產(chǎn)酯酵母∶耐酸酵母=1∶4（V/V）。

圖2 酵母菌接種比例對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum ratio on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.3 初始pH值對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著初始pH值增大，野生火棘果保健果酒的感官評分呈現(xiàn)出先快速升高后降低的趨勢。當pH值為5.5時，感官評分最高，為88分。這可能是酵母菌生長對pH值的變化比較敏感，極端pH值條件下，酵母菌產(chǎn)香能力和酒精代謝能力會受到抑制，使得酒體單薄味寡，只有在最適生長pH值下，酵母菌生長代謝活躍，向著更有利于產(chǎn)酒精和香氣的方向發(fā)展。因此，選擇最佳初始pH值為5.5。

圖3 初始pH值對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial pH on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.4 發(fā)酵溫度對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度升高，野生火棘果保健果酒感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵溫度為22 ℃時，感官評分最高，為93分。感官評分最高時的發(fā)酵溫度卻不是酵母菌的最適生長溫度，原因是當進行低溫發(fā)酵時，可以有效將酵母菌代謝的香氣成分保留在酒體中，使得酒體宜人也不粗糙，低溫發(fā)酵已經(jīng)是一種趨勢。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.1.5 發(fā)酵時間對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間延長，野生火棘果保健果酒感官評分呈現(xiàn)先快速增大再緩慢下降的趨勢。第8天時，野生火棘果保健果酒的感官評分最高，為93分。這是由于當發(fā)酵時間較短時，發(fā)酵進行不充分，殘?zhí)呛枯^高，酒精度和香氣成分還積累不夠，從而影響感官評分；當發(fā)酵時間過長時，發(fā)酵液環(huán)境惡化，不利于酵母菌生長繁殖，這時候酵母菌可能會大量自溶或者代謝不良產(chǎn)物，從而影響酒體感官評分。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為8 d。

圖5 發(fā)酵時間對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on wild Pyracantha fortuneana health wine quality

2.2 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 響應面試驗方案設計及試驗結果

鑒于單因素試驗結果，選取接種量（A）、初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）等4個因素為自變量，以野生火棘果保健果酒感官評分（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面優(yōu)化試驗，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 野生火棘果保健果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for wild Pyracantha fortuneana health wine fermentation technology optimization

續(xù)表

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

根據(jù)Box-Benhnken試驗設計原理，以感官評分為響應值，利用Design-Expert.V8.06對表3試驗數(shù)據(jù)分析，得回歸方程：Y=94.00+2.00A+0.17B-3.42C+3.92D+0.75AB-2.50AC-2.25AD+0.50BC+1.75BD-2.75CD-4.92A2-3.67B2-11.54C2-6.04D2

由表4可知，模型極為顯著（P＜0.001）。決定系數(shù)R2=0.972 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.945 3，失擬項P=0.214 3＞0.05，不顯著，綜上說明回歸方程擬合度較好，自變量與響應面之間線性關系顯著，可有效對野生火棘果保健果酒感官評分進行理論預測。本模型中A、C、D、A2、B2、C2、D2對結果影響差異極顯著（P＜0.01），AC、AD、CD對結果影響差異顯著（P＜0.05），其余項差異為不顯著（P＞0.05）。根據(jù)表4的方差分析對野生火棘果保健果酒感官評分影響程度依次為：D＞C＞A＞B，即發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量＞初始pH值。

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments

圖6 各因素交互作用對野生火棘果保健果酒感官評分影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation score of wild Pyracantha fortuneana health wine

在其他試驗自變量因素固定不變的條件下，考察兩兩因素的交互作用對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響，用Box-Behnken試驗得到的多元二次回歸模型制作響應面圖，結果見圖6。由圖6可知，響應面坡度越陡峭，表明響應值對操作條件的改變越敏感，該因素對野生火棘果保健果酒品質(zhì)的影響越大；反之則表明因素對野生火棘果保健果酒品質(zhì)影響越小。接種量與發(fā)酵溫度、接種量與發(fā)酵時間、發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間的交互作用明顯，其他因素之間交互作用不是很顯著，這與表3中的方差分析結果是一致的。

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝確定與驗證試驗

利用Design-Expert.V.8.06軟件進行發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化組合，預測最佳工藝條件為：接種量9.18%、初始pH值5.56、發(fā)酵溫度21.58 ℃、發(fā)酵時間8.35 d，在此條件下野生火棘果保健果酒感官評分預測值為95.24分?？紤]到實際情況，將最佳工藝條件參數(shù)調(diào)整為接種量為9%、初始pH值為5.5、發(fā)酵溫度為22 ℃、發(fā)酵時間為8 d。在此工藝條件下進行3次平行試驗取平均值實際感官評分為94.61分，與預測值偏差不大，說明回歸模型能較好反應野生火棘果保健果酒的發(fā)酵工藝。

2.3 野生火棘果保健果酒品質(zhì)評價

該發(fā)酵所得果酒色澤鮮艷、果香濃郁、口感醇厚、整體飽滿協(xié)調(diào)。酒精度為11.5%vol～12%vol，殘?zhí)牵?.1%。細菌總數(shù)＜50 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；未檢出沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌。

3 結論

本研究以實驗室保藏的耐酸酵母菌株Y2-1和產(chǎn)酯酵母菌株T6-1為試驗菌株，將野生火棘果果汁與枸杞果漿混合，調(diào)節(jié)初始糖度為21%，果膠酶添加量為35 mg/L，SO2添加量為70 mg/L，以產(chǎn)酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1接種比例為1∶4（V/V）進行發(fā)酵。在單因素試驗基礎上，以野生火棘果保健果酒感官評分為考察指標，通過Box-Behnken響應面設計優(yōu)化，建立了野生火棘果保健果酒的最佳發(fā)酵工藝條件：接種量為9%，初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時間為8 d。在此條件下發(fā)酵的野生火棘果保健果酒色澤鮮艷、果香濃郁、口感醇厚、整體飽滿協(xié)調(diào)，酒精度為11.5%vol～12%vol，感官評分達到94.61 分。