李亦軒 江帥菲 董明亮 齊帥征 張金鳳

(林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

油松(PinustabulaeformisC.)為松科針葉常綠喬木，是我國特有的樹種，也是我國華北、東北等地區(qū)主要的造林樹種和用材樹種。油松用途廣泛，具有良好的經(jīng)濟價值，生態(tài)價值和觀賞價值；并且油松抗瘠薄、抗風，適應惡劣環(huán)境的能力強，在我國的生態(tài)建設中發(fā)揮了非常重要的作用[1]。但是，到目前為止，油松的繁殖效率還很低，存在生長周期長、有性繁殖后代變異較大、扦插等無性繁殖生根率低等問題；同時，蟲害和各種疾病又造成了油松種子產(chǎn)量的下降。因此，需要一種新方法來提高油松優(yōu)良材料的繁殖效率。

體細胞胚胎發(fā)生技術是一種大規(guī)模繁殖的有效方法[2]，外植體在特定條件下，未經(jīng)性細胞融合而是經(jīng)過了一個與合子胚胎發(fā)生類似的過程，發(fā)育形成具有雙極性的胚狀結構的過程[3]。體細胞胚胎發(fā)生可以作為大規(guī)模繁殖的有效方法，特別是對于使用常規(guī)無性繁殖難以繁殖的優(yōu)良基因型[2]。與其他傳統(tǒng)的繁育方法相比，體細胞胚胎發(fā)生技術具有繁殖速度快、數(shù)量多、不受季節(jié)影響、優(yōu)良性狀后代能夠穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點[4]。體細胞胚的成熟是體胚發(fā)生體系的關鍵環(huán)節(jié)之一，許多因素直接影響細胞的分化，進而影響體胚的產(chǎn)生。因此，篩選和優(yōu)化油松體細胞胚成熟過程的影響因素尤為重要。

以現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，油松胚性愈傷組織成胚率低，而在一些愈傷組織中甚至沒有體胚的產(chǎn)生。為了最大程度發(fā)揮油松胚性愈傷的胚性，提高體胚的數(shù)量和質量，本研究對現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了調(diào)整和優(yōu)化，以油松胚性愈傷組織為試驗材料，研究了成熟培養(yǎng)基中ABA質量濃度、PEG質量濃度、植物凝膠質量濃度、麥芽糖和蔗糖質量濃度對于體胚數(shù)量的影響，同時以成熟率對現(xiàn)有的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，希望能夠篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳的培養(yǎng)條件以提高油松體細胞胚成熟率，為油松的高效繁殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以本實驗室前期積累的胚性細胞系為材料[5]，選擇增殖能力強，胚性比較好的胚性細胞系15c4b，16c4a等,見圖1。

圖1 油松胚性愈傷組織

1.2 試驗方法

1.2.1 基礎固體成熟培養(yǎng)基

使用針葉樹基礎培養(yǎng)基[6]，并添加酶水解酪蛋白0.5 g·L-1，pH調(diào)至5.8，谷氨酰胺0.5 g·L-1(過濾滅菌后加入)，含ABA 8 mg·L-1、PEG4000質量濃度50 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1、蔗糖30 g·L-1。

1.2.2固體成熟培養(yǎng)基中4種影響因素水平的設置

成熟培養(yǎng)基中ABA質量濃度分別設置為6、10、14、18、22 mg·L-1；PEG4000質量濃度分別設置為25、50、75、100、125 g·L-1；在成熟培養(yǎng)基中依次添加1.5(能使培養(yǎng)基凝固的最少含量)、2.0、2.5、5.0、7.5 g·L-1的植物凝膠；在成熟培養(yǎng)基中添加麥芽糖和蔗糖兩類糖，其質量濃度組合分別為：0+40、12.5+27.5、15+25、22.5+17.5、40+0 g·L-1，用裝有剪去尖端槍頭的移液槍吸取等量的懸浮愈傷組織噴撒在固體成熟培養(yǎng)基表面，吸去多余水分，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7～8周后統(tǒng)計體胚的數(shù)量，每個單因素試驗重復3次。

1.3 正交設計與驗證

利用正交試驗設計，以ABA質量濃度、PEG質量濃度、植物凝膠質量濃度、糖的種類和質量濃度4個因素的單因素分析最優(yōu)結果為中心值，上下各挑選1個梯度值共3個水平，采用L9(34)正交設計開展試驗，選出最優(yōu)組合，試驗重復3次。

為了驗證調(diào)整后的培養(yǎng)基的成胚效果，7～8周后分別統(tǒng)計原培養(yǎng)基與調(diào)整后的培養(yǎng)基體胚的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)7～8周以后，對每盤體胚的數(shù)量進行統(tǒng)計，結果取平均值±標準差。使用Microsoft Excel和SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，利用最小顯著極差法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 成熟培養(yǎng)基中ABA、PEG、植物凝膠和糖類對體胚數(shù)量的影響

從表1中可以看出隨著成熟培養(yǎng)基中ABA質量濃度的增加，體胚的數(shù)量呈現(xiàn)上升的趨勢，當增加到一定濃度的時候，體胚的數(shù)量呈下降的趨勢。綜合來看，成熟培養(yǎng)基中ABA質量濃度為14～18 mg·L-1時，其誘導體胚的效果顯著，尤其在18 mg·L-1時，體胚的數(shù)量最高。

當成熟培養(yǎng)基中PEG的質量濃度為25 g·L-1時，體細胞胚的數(shù)量較低，隨著PEG質量濃度的升高，體胚的數(shù)量明顯上升，在PEG濃度為50～100 g·L-1時，成胚的效果最明顯。綜合來看，培養(yǎng)基中添加75 g·L-1PEG時，獲得的體胚的數(shù)量最高。

隨著植物凝膠含量的增加，體細胞胚的數(shù)量呈逐漸升高的趨勢，當植物凝膠為7.5 g·L-1時，體胚的數(shù)量下降。綜合來看，成熟培養(yǎng)基中植物凝膠質量濃度為2.5～5.0 g·L-1時，對體胚的形成影響最好，在植物凝膠濃度為5.0 g·L-1時，體胚的數(shù)量最高。

從表1中結果可得知隨著麥芽糖和蔗糖質量濃度的變化，體胚的數(shù)量呈現(xiàn)上升的趨勢；當增加到一定濃度時，體胚的數(shù)量有所下降；綜合來看，當成熟培養(yǎng)基中麥芽糖和蔗糖質量濃度為(15+25)g·L-1，對成胚的效果較好。

表1 不同質量濃度ABA、PEG、植物凝膠和糖類對體胚數(shù)量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 正交試驗結果

根據(jù)上述結果，選出4個因素最優(yōu)范圍內(nèi)3個水平進行正交試驗，7～8周后愈傷組織產(chǎn)生體胚的數(shù)量如表2和表3所示。2號處理組產(chǎn)生體胚的數(shù)量最多，平均每克胚性愈傷組織可以得到35.6個體胚；9號處理組獲得的體胚數(shù)量最低，僅為12個。極差分析顯示，本試驗最優(yōu)組合為ABA質量濃度為16 mg·L-1，PEG質量濃度為75 g·L-1，植物凝膠質量濃度為5 g·L-1，麥芽糖和蔗糖質量濃度為10+30 g·L-1。方差分析(表4)的結果顯示，在0.05水平下，ABA、PEG、植物凝膠和糖類配比對成熟體細胞胚的數(shù)量具有顯著影響，其中ABA影響最為顯著，其次為PEG、糖類；植物凝膠影響不顯著。

表2 ABA、PEG、植物凝膠和糖類對體胚數(shù)量影響的正交試驗結果

編號ABA質量濃度/mg·L-1PEG質量濃度/g·L-1凝膠質量濃度/g·L-1麥芽糖+蔗糖質量濃度/g·L-1體胚數(shù)量/個·g-1116603.010+3030.0±2.86216755.015+2535.6±6.79316907.020+2014.0±1.24418605.020+2017.3±1.69518757.010+3026.3±4.10618903.015+2515.0±2.94720607.015+2514.0±5.01820753.020+2015.0±6.16920905.010+3012.0±2.49

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基驗證

從圖2和圖3中可以看出隨著培養(yǎng)時間的增加，體胚的數(shù)量也逐漸增加，調(diào)整后的培養(yǎng)基體胚的數(shù)量明顯大于原培養(yǎng)基中體胚的數(shù)量，在第9周，優(yōu)化培養(yǎng)基上體胚數(shù)量可達51個/g，原培養(yǎng)基為27個/g，提高了0.8倍。另外，與原培養(yǎng)基相比，調(diào)整后的培養(yǎng)基上出現(xiàn)體胚的時間較早，從第5周就出現(xiàn)體胚，且體胚增加速度更快，所以調(diào)整后的成熟培養(yǎng)基成分更有利于體胚的產(chǎn)生。

表3 ABA、PEG、植物凝膠和糖類對體胚數(shù)量影響的正交試驗極差分析

指標各因素不同梯度時測定的體胚數(shù)量/個·g-1ABA質量濃度PEG質量濃度凝膠質量濃度麥芽糖+蔗糖質量濃度K126.520.4320.022.76K219.525.6321.621.53K313.613.6018.115.43R12.912.033.57.33

注：最優(yōu)組合為ABA質量濃度為16 mg·L-1、PEG質量濃度為75 g·L-1、植物凝膠質量濃度為5 g·L-1、麥+蔗糖質量濃度為(10+30)g·L-1。

表4 油松體胚成熟培養(yǎng)基試驗方差分析

注：*表示在P<0.05水平差異顯著。

A.成熟培養(yǎng)基中體細胞胚生長狀態(tài)；黑色箭頭表示油松體細胞胚；B.體式顯微鏡下觀察到的成熟培養(yǎng)基體細胞胚狀態(tài)，箭頭表示胚柄和胚頭。

圖2 油松體細胞胚生長狀態(tài)

圖3 培養(yǎng)基調(diào)整前后體胚數(shù)量的統(tǒng)計

3 結論與討論

油松體細胞胚胎發(fā)生是一個相對復雜的過程，其中成熟階段是最為重要的一個環(huán)節(jié)，受到許多因素的影響，例如成熟培養(yǎng)基的成分，培養(yǎng)環(huán)境的溫度，外源激素的種類與濃度，繼代周期的長短，細胞系的胚性以及母樹基因型來源等[7]。本文探究了ABA質量濃度、PEG質量濃度、植物凝膠及糖的種類和質量濃度對油松體細胞胚成熟率的影響。

油松細胞系在增殖過程中，培養(yǎng)基上殘留的植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D和6-BA對成熟階段體細胞胚的產(chǎn)生會造成影響[8]，所以油松愈傷組織材料在進入成熟培養(yǎng)之前，要先進行預處理，其目的就是除去材料上吸附的植物生長調(diào)節(jié)劑。本試驗采用懸浮培養(yǎng)的方式處理試驗材料，除了提高植物材料的利用率以外，也能夠使材料與液體培養(yǎng)基充分接觸。

ABA在許多物種體細胞胚胎發(fā)生過程中起到非常重要的作用，尤其是針葉樹[9]。已經(jīng)有研究證明，在成熟培養(yǎng)基中添加適量濃度的ABA能夠顯著提高胚性愈傷組織成胚率和質量[10]，杜克久等在山茶花體胚發(fā)生體系的研究中，添加ABA后山茶花體胚可達70-75%[11]。在其他有關針葉樹體胚成熟的研究中，宋躍等報道了有關長白落葉松體細胞胚胎發(fā)生的初步結果，結果表明ABA的質量濃度和滲透壓的改變，對落葉松體細胞胚的影響顯著，最佳數(shù)量可達(204±4)g-1[12]。本試驗結果也表明在探索影響成熟階段體細胞胚胎發(fā)生的幾個因素中，ABA對其成胚的影響最為顯著。ABA在外植體進行組織培養(yǎng)時，能夠減少植物組織產(chǎn)生的裂生多胚的數(shù)量，使組織胚胎分散成單個胚，即起到了使胚從增殖生長狀態(tài)向成熟狀態(tài)轉變的作用[13]。適宜的ABA能夠改善愈傷組織的狀態(tài)，使其結構細密，逐漸失水保持干燥[14]，提高體細胞胚的質量，減少畸形胚，提高成胚率[15]，這可能與體細胞胚胎發(fā)生過程中一些特定表達的基因有關[16]。

針葉樹體細胞胚胎發(fā)生也受碳水化合物的類型和濃度的影響[17-18]。在華北落葉松的體細胞胚胎發(fā)生的過程中，蔗糖的質量濃度會顯著影響體細胞胚的質量和數(shù)量[19]；云杉的體細胞胚胎發(fā)生過程中，過高濃度的蔗糖不利于體細胞胚的發(fā)生[18]；與蔗糖相比，麥芽糖更有利于火炬松體細胞胚胎的發(fā)生[20]，用麥芽糖代替蔗糖，不僅顯著提高了體細胞胚成熟率,而且使體細胞胚發(fā)生時間提前一周；與蔗糖相比，在麥芽糖中體細胞胚質量明顯改善，體細胞胚體積小，大小均一，畸形胚很少[21]。本研究中可以看到，與同時含有麥芽糖和蔗糖的處理組相比，單只含有一種糖類的處理組得到的成熟體細胞胚的數(shù)量小于前者，這說明在體細胞胚胎成熟過程中，同時添加麥芽糖和蔗糖有利于體細胞胚數(shù)量的提高。麥芽糖除了提供體胚發(fā)生過程中的碳源和能量外，也會對體細胞胚胚柄的生長有一定程度的抑制作用[17]；在只含蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，會出現(xiàn)胚柄過度生長，抑制胚頭的生長發(fā)育等現(xiàn)象，造成體細胞胚畸形，甚至死亡，最終降低成胚率，用麥芽糖代替蔗糖時，這種現(xiàn)象的發(fā)生率降低[17，22]。

已有的研究表明PEG對培養(yǎng)基調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，且經(jīng)PEG處理的愈傷組織細胞的活力和有絲分裂能力均較高，有利于后續(xù)成熟培養(yǎng)[23]。齊力旺等對華北落葉松體細胞胚胎發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，添加75 g·L-1PEG4000每克愈傷組織得到82.7個子葉胚[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG4000濃度過高或過低都會影響體胚的數(shù)量，PEG4000在75 g·L-1時體胚數(shù)量最多。以上結果說明在針葉樹體細胞胚胎發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

植物凝膠的含量多少對培養(yǎng)基的軟硬程度有影響。當含量過多時，培養(yǎng)基過于堅硬，不僅會影響胚性愈傷組織生長狀態(tài)，組織表面干化，呈結晶狀，影響組織轉向成熟狀態(tài)的發(fā)育，而且會影響體細胞胚的形態(tài)和生長狀況；而植物凝膠含量過少時，胚性愈傷組織周圍會有水份堆積，也會影響其胚性的發(fā)展。但是本研究發(fā)現(xiàn)，植物凝膠對油松體細胞胚的影響不顯著，已有的研究，也未發(fā)現(xiàn)植物凝膠對油松愈傷組織有顯著影響[5]，這與本研究結論一致。

針葉樹的體細胞胚胎發(fā)生的成熟階段是比較困難的，在愈傷組織增殖的過程中由于繼代時間長，機械損傷等原因會造成胚性的喪失。不同的基因型細胞系的胚性也不盡相同，所以在成熟培養(yǎng)階段，要根據(jù)細胞系的胚性狀況，合理的調(diào)節(jié)和改進成熟培養(yǎng)基的成分，一般可以得到較好的效果，為了選著出最適的成分配比本研究在單因素分析的基礎上開展了正交設計試驗及驗證，當ABA質量濃度14～18 mg·L-1、PEG質量濃度為50～100 g·L-1、植物凝膠質量濃度為2.5～5.0 g·L-1、麥芽糖和蔗糖質量濃度為(15+25)g·L-1時，進一步提高了體胚的成熟率，為油松的大規(guī)模繁殖提供了技術基礎，并為后續(xù)油松基因工程遺傳轉化，提供了材料和技術平臺。