王營(yíng) 關(guān)春景 崔穎 劉彬 張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

細(xì)葉百合(Liliumpumilum)是百合屬中分布區(qū)域最廣，分布緯度偏北的種之一，其適應(yīng)范圍廣，極耐寒，耐干旱與鹽堿，是百合抗性育種的重要親本[1]。其花瓣反卷鮮紅色，鱗莖可食，是一種兼具食用、藥用和觀賞價(jià)值的植物[2-3]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)受到如高溫、干旱、寒冷和高鹽等非生物脅迫，而植物通過(guò)調(diào)節(jié)一系列功能基因和調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)抵御外界的各種非生物脅迫[4]。AP2/EREBP，WRKY，bZIP，MYB和NAC等類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子(TF)作為重要的調(diào)控基因通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來(lái)參與植物逆境脅迫反應(yīng)調(diào)控[5-6]。其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子作為近10年新發(fā)現(xiàn)的最大的一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控方式包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控[7-12]。根據(jù)生物信息學(xué)對(duì)全基因轉(zhuǎn)錄組分析，預(yù)測(cè)有20%～25%的NAC基因?qū)χ辽僖环N或幾種脅迫有響應(yīng)[13-14]。大量關(guān)于NAC基因參與非生物脅迫應(yīng)答的研究相繼被報(bào)道，如通過(guò)對(duì)中國(guó)白菜(Brassicarapapekinensis)基因組分析，部分BrNACs基因響應(yīng)低溫、ABA、GA和PEG等非生物脅迫，基因表達(dá)為上調(diào)[15]；從柚(Citrusmaxima)、枳(Poncirustrifoliata)和檸檬(C.limon)分離出的CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83基因響應(yīng)ABA、干旱、低溫和高鹽脅迫，且在不同的柑橘種類(lèi)中存在表達(dá)差異[16]；從紫花苜蓿(Medicagosativa)中克隆的MsNAC1和MsNAC2基因響應(yīng)鹽、寒冷和干旱等非生物脅迫[17-18]；從小麥(Triticumaestivum)中克隆的的TaNAC4基因響應(yīng)高鹽和低溫脅迫[19]；從大豆中鑒定出了第一個(gè)類(lèi)似ATAF1的NAC轉(zhuǎn)錄因子GmNAC2，作為負(fù)調(diào)控因子在煙草中過(guò)量表達(dá)能夠降低非生物脅迫的耐受性[20]；胡楊(Populuseuphratica)中PeNAC1基因強(qiáng)烈響應(yīng)干旱和鹽脅迫，脫落酸(ABA)處理只是輕微誘導(dǎo)PeNAC1基因的表達(dá)[21]；從鹽生植物遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensis)克隆的SlNAC1基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)能夠提高抗旱、抗寒和耐鹽的能力[22]；從鷹嘴豆(Cicerarietinum)中克隆的CarNAC4基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)提高抗旱和耐鹽能力，同時(shí)提高了脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)如RD29A、ERD10、COR15A、COR47、KIN1和DREB2A的表達(dá)量[23]；從大麥(Hordeumvulgare)和高粱(Sorghumbicolor)的克隆的HvSNAC1和SbSNAC1基因均有提高轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的能力[24-25]。隨著更多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)及被證明參與植物非生物脅迫應(yīng)答，將有助于更深入的揭示植物非生物應(yīng)答的分子機(jī)制，也有助于培育更多具有較強(qiáng)抗性的新品種。

本研究從細(xì)葉百合cDNA文庫(kù)[26]篩選出NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中表達(dá)量高，開(kāi)放閱讀框完整且具有保守結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行克隆，得到1個(gè)新的NAC家族基因LpNAC13，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)其在低溫、高鹽、干旱逆境脅迫和ABA處理下的時(shí)空表達(dá)模式做出初步分析，以期為細(xì)葉百合抗逆分子育種提供候選基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

選自東北林業(yè)大學(xué)苗圃單頭沒(méi)有害蟲(chóng)或疾病的細(xì)葉百合鱗莖，用多菌靈處理約30 min，經(jīng)洗滌和干燥后，以蒸汽滅菌的濕珍珠巖作為儲(chǔ)存介質(zhì)，放入4 ℃的冰箱中解除休眠后，進(jìn)行總RNA提取。利用細(xì)葉百合鱗莖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1)培養(yǎng)30 d獲得再生芽后，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1)上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件(16 h光照，8 h黑暗；75%～80%相對(duì)濕度；25 ℃)。當(dāng)苗高達(dá)5 cm左右時(shí)，采用水培的方式預(yù)培養(yǎng)7 d，然后分別移到200 mM NaCl(鹽脅迫)，20% PEG 6000(干旱脅迫)，150 μM ABA和2 ℃(低溫脅迫)溶液中，均以室溫(25 ℃)不加處理的液體培養(yǎng)細(xì)葉百合幼苗作對(duì)照，分別在處理后0、1、3、6、12、24和48 h取其根、鱗莖和葉片，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?株細(xì)葉百合幼苗為一組，每組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 cDNA合成

根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)(TaKaRa)將解除休眠的細(xì)葉百合鱗莖總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一條鏈cDNA，用于基因克隆試驗(yàn)；根據(jù)Rever Tra Ace qPCR RT Kit Realtime說(shuō)明書(shū)(TOYOBO)將細(xì)葉百合各脅迫處理的3個(gè)組織部位的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 LpNAC13基因克隆

根據(jù)細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中LpNAC13的cDNA序列用Premier 5設(shè)計(jì)特異性上下游引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，65～55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃最終延伸10 min，4 ℃保存。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，與pMD-18T載體過(guò)夜連接[27]，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并挑取單菌落PCR驗(yàn)證后過(guò)夜搖菌，將檢測(cè)到含有目的基因的菌液送測(cè)序。

表1 克隆及定量分析引物

1.4 LpNAC13基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI、ExPASy、Protscale、TMPred、WOLFPSORT、SignalP、SOPMA2.0、SWISS-MODEL、NetGlycate1.0、PlantTFDB等生物信息網(wǎng)站，以及DNAMAN、MEGA6.0等生物信息軟件對(duì)獲得的細(xì)葉百合LpNAC13基因的全長(zhǎng)cDNA序列及所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分子特征、理化性質(zhì)、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化等一系列分析預(yù)測(cè)。

1.5 細(xì)葉百合LpNAC13時(shí)空表達(dá)特性

以百合LilyActin基因[28](GenBank登錄號(hào)：JX826390)為內(nèi)參基因，在線引物設(shè)計(jì)軟件premier3input設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以提取細(xì)葉百合幼苗葉片、鱗莖和根總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ABA、干旱、低溫和鹽脅迫下LpNAC13基因在不同組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Real-Time PCR master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，Primer-F 0.5 μL，Primer-R 0.5 μL，ddH2O 8 μL，共20 μL。采用SYBR Green在Poche Light Cycler96進(jìn)行行如下反應(yīng)程序：初始變性：95 ℃、30 s；3步法：95 ℃、5 s，58 ℃、15 s,72 ℃、10 s共45個(gè)循環(huán)；溶解：95 ℃、10 s，60 ℃、60 s,97 ℃、1 s；冷卻：37 ℃、60 s。每處理樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[26]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行方差分析，利用SigmaPlot 12.5進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)葉百合LpNAC13基因的克隆

以細(xì)葉百合鱗莖cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)得到單一、特異的擴(kuò)增帶，片段大小約為600 bp(圖1)。經(jīng)過(guò)膠回收純化連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化涂板，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆菌(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示LpNAC13開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)是627 bp，可以編碼208個(gè)氨基酸，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比完全符合。

M為DL2000;1為L(zhǎng)pNAC13基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 細(xì)葉百合LpNAC13基因序列生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果顯示LpNAC13基因大小為627 bp，提交GenBank得到登錄號(hào)為MF398204。利用NCBI中ORF Finder進(jìn)行分析，結(jié)果表明627 bp序列均為完整的ORF，推測(cè)編碼208個(gè)氨基酸。Conserved Domains保守區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明LpNAC13基因在16～127氨基酸處存在一個(gè)高度保守的NAM域，屬于NAC基因家族(圖3)。

M為DL 2000;1-10為L(zhǎng)pNAC13菌落PCR產(chǎn)物。

利用Protparam生物信息學(xué)工具對(duì)LpNAC13基因編碼氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：LpNAC13基因編碼208個(gè)氨基酸，分子量23.425 kDa，理論等電點(diǎn)為9.58，分子式為C1022H1641N309O305S9，不穩(wěn)定系數(shù)45.55，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白，反之不穩(wěn)定)；脂肪簇氨基酸指數(shù)76.92；親水性平均系數(shù)為-0.523，推測(cè)該基因所編碼的蛋白為親水性蛋白(親水指數(shù)正值代表疏水，負(fù)值代表親水)；正負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為34和24，表示其在中性環(huán)境中帶正電荷，其中精氨酸含量最高，占10.6%，其次為絲氨酸9.1%和亮胺酸8.2%。

圖3 LpNAC13的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用Protscale預(yù)測(cè)LpNAC13基因編碼蛋白親/疏水性(圖4)，顯示其在第134位氨基酸殘基處具有最強(qiáng)親水性，最低值為-2.533，在46位氨基酸殘基處具有最強(qiáng)疏水性，最高值為1.667，位于親水區(qū)的蛋白占絕大多數(shù)，表明LpNAC13蛋白為親水蛋白，與其預(yù)測(cè)為親水蛋白相吻合。

利用TMPred對(duì)LpNAC13編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，該蛋白肽鏈位于膜外，推測(cè)其可能沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。利用WOLF PSORT對(duì)LpNAC13編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析,預(yù)測(cè)顯示LpNAC13位于細(xì)胞核可能性為28.57%，位于線粒體可能性為28.57%，葉綠體21.43%，液泡14.29%，推測(cè)LpNAC13蛋白可能定位在細(xì)胞核或線粒體中，具體位置有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證明。利用SignalP預(yù)測(cè)LpNAC13蛋白不含有信號(hào)肽，為非分泌性蛋白。

圖4 LpNAC13親/疏水性預(yù)測(cè)

利用SOPMA2.0對(duì)LpNAC13蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖5)，LpNAC13蛋白由29.81%的α螺旋、16.83%的延伸鏈、6.25%的β轉(zhuǎn)角以及47.12%的無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。

藍(lán)色為α-螺旋；紅色為延伸鏈；綠色為β-轉(zhuǎn)角；紫色為無(wú)規(guī)則卷曲。

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步纏繞和折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)。利用SWISS-MODEL在線同源建模法對(duì)預(yù)測(cè)的LpNAC13蛋白進(jìn)行三維同源建模分析，預(yù)測(cè)以同型二聚體形式存在(圖6)。

圖6 LpNAC13蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

利用NetGlycate1.0和NetPhos2.0預(yù)測(cè)LpNAC13蛋白的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示LpNAC13有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于36、40、88、106和142氨基酸殘基處，預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)共有18個(gè)，包括絲氨酸位點(diǎn)11個(gè)，蘇氨酸位點(diǎn)6個(gè)和酪氨酸位點(diǎn)1個(gè)。

利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)LpNAC13轉(zhuǎn)錄因子的功能，結(jié)果顯示LpNAC13的最佳匹配基因是擬南芥ANAC083，也稱(chēng)為ANAC083/VNI2[29]，在發(fā)育中參與鹽脅迫響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、木質(zhì)部發(fā)育、葉片衰老、抗病毒、轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，DNA模板化等進(jìn)程，預(yù)測(cè)LpNAC13可能在細(xì)葉百合生長(zhǎng)發(fā)育中參與上述活動(dòng)進(jìn)程。

在NCBI上通過(guò)BLASTp對(duì)LpNAC13編碼蛋白與其它已知植物中NAC結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)LpNAC13序列與海棗(Phoenixdactylifera)的NAC蛋白具有最高同源性，同源性達(dá)到56.32%，與油棕(Elaeisguineensis)、石榴(Punicagranatum)、軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)、川桑(Morusnotabilis)、亞洲棉(Gossypiumarboreum)、葡萄(Vitisvinifera)、荷花(Nelumbonucifera)NAC蛋白也具有較高的同源性，分別達(dá)到55.81%、53.53%、53.22%、53.18%、52.91%、52.63%和52.57%，并將LpNAC13推測(cè)的氨基酸序列與這些物種的NAC蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，一致性達(dá)到53.43%(圖7)。證明克隆出的1個(gè)基因?qū)儆谥参颪AC轉(zhuǎn)錄因子家族。

為了進(jìn)一步揭示細(xì)葉百合LpNAC13蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA6軟件的鄰接法將LpNAC13蛋白質(zhì)序列與從擬南芥基因組TAIR中下載的15個(gè)擬南芥NAC蛋白質(zhì)序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明LpNAC13與NAC083在同一枝進(jìn)化樹(shù)上(圖8)；參照Ooka等[30]對(duì)NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)方法將這些基因分為ANAC011、NAM、SENU5、ANAC001、ONAC003等5個(gè)亞族，分析結(jié)果顯示LpNAC13與擬南芥NAC083在同一枝進(jìn)化樹(shù)上，親緣關(guān)系較近，可能屬于SENU5亞族。

2.3 在非生物脅迫下LpNAC13基因表達(dá)

對(duì)細(xì)葉百合幼苗進(jìn)行ABA、干旱、低溫和鹽脅迫處理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析LpNAC13基因在根、鱗莖和葉片組織中不同時(shí)間的表達(dá)水平，結(jié)果表明(表2～表5)，在150 μMol ABA、20% PEG 6000、2 ℃低溫與200 mM NaCl逆境脅迫誘導(dǎo)下，LpNAC13在根、莖和葉中均有表達(dá)。

ABA誘導(dǎo)下(表2)：在根中，LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量在前6 h急劇上升且在6 h達(dá)到最大值，為對(duì)照的12.21倍，可見(jiàn)ABA可以誘導(dǎo)LpNAC13在根中迅速表達(dá)，12 h后，LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，整體變化幅度很大，整體呈先急劇升高后快速下降的趨勢(shì)；鱗莖中：LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量在前12 h均低于對(duì)照組，而從24 h開(kāi)始高于對(duì)照且在48 h時(shí)上升達(dá)到最大值，為對(duì)照的11.70倍，LpNAC13表達(dá)量變化幅度較大，可見(jiàn)ABA誘導(dǎo)LpNAC13在鱗莖中的大量表達(dá)需要一定的時(shí)間；在葉片中，LpNAC13表達(dá)量在48 h內(nèi)均高于對(duì)照，整體呈上調(diào)趨勢(shì)，24 h時(shí)，表達(dá)量急劇上升達(dá)到最大值，為對(duì)照的8.85倍。

XP_008813225.1為海棗，XP_010907664.1為油棕，OWM89804.1為石榴，AID55351.1為軟棗獼猴桃，XP_010090688.1為川桑，XP_017612730.1為亞洲棉，RVW31991.1為葡萄，XP_010249131.1為荷花。A、B、C、D、E下劃線部分分別代表NAC結(jié)構(gòu)域中5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域。

圖7 細(xì)葉百合LpNAC13基因編碼的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列多重比對(duì)

NAC075為AT4G29230.1，NAC099為AT5G56620.1，ANAC010為AT1G28470.1，ANAC073為AT4G28500.1，NAC044為AT3G01600.1，NAC005為AT1G02250.1，ANAC003為AT1G02220.1，ANAC004為AT1G02230.1，NAC083為AT5G13180.1，NAC071為AT4G17980.1，CUC1為AT3G15170.1，CUC2為AT5G53950.1，NAC096為AT5G46590.1，ANAC011為AT1G32510.1，ANAC038為AT2G24430.1。

圖8 細(xì)葉百合LpNAC13蛋白氨基酸序列與擬南芥氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

表2 ABA脅迫處理下細(xì)葉百合LpNAC13在其根、鱗莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平

時(shí)間/h根鱗莖葉0(1.00±0)Bc (1.00±0)BCb (1.00±0)Cd 1(2.90±0.26)Bc(0.68±0.04)BCbc(4.29±0.84)Bb3(4.98±0.81)Bbc(0.23±0.03Cc)(3.15±0.37)BCbc6(12.21±1.63)Bb(0.85±0.01)BCb(1.62±0.53)Ccd12(0.84±0.05)Aa(0.93±0.05)BCb(1.62±0.13)Ccd24(0.29±0.04)Bc(1.14±0.29)Bb(8.85±0.92)Aa48(0.79±0.10)Bc(11.70±0.35)Aa(3.24±0.05)BCbc

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.05水平上差異顯著；同列不同大寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.01水平上差異極顯著。

PEG誘導(dǎo)下(表3)：在根中，LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量在3 h到最大值，為對(duì)照的1.13倍，6 h后，LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，表達(dá)量變化幅度相對(duì)平穩(wěn)；鱗莖中：LpNAC13表達(dá)量在48 h內(nèi)均高于對(duì)照，整體呈上調(diào)趨勢(shì)，且在3 h時(shí)表達(dá)量急劇上升達(dá)到最大值，為對(duì)照的44.69倍，可見(jiàn)，在鱗莖中LpNAC13對(duì)干旱脅迫非常敏感，可誘導(dǎo)LpNAC13的大量表達(dá)；在葉片中：LpNAC13表達(dá)量在前24 h內(nèi)均高于對(duì)照，在48 h趨于對(duì)照，整體呈上調(diào)趨勢(shì)，且在1 h時(shí)表達(dá)量急劇上升達(dá)到最大值，為對(duì)照的5.56倍，可見(jiàn)PEG可以誘導(dǎo)LpNAC13在葉片中迅速表達(dá)。

2 ℃低溫誘導(dǎo)下(表4)：根中，LpNAC13的相對(duì)表達(dá)量在前6 h均高于對(duì)照組，且在6 h時(shí)上升達(dá)到最大值，為對(duì)照的12.27倍，從12 h開(kāi)始，表達(dá)量開(kāi)始迅速下降，均低于對(duì)照組，整體變化幅度很大；鱗莖和葉片中：LpNAC13相對(duì)表達(dá)量在48 h內(nèi)均低于對(duì)照，整體呈下調(diào)趨勢(shì)，可以看出，LpNAC13對(duì)冷脅迫不太敏感。

表3 PEG脅迫處理下細(xì)葉百合LpNAC13在其根、鱗莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平

時(shí)間/h根鱗莖葉0(1.00±0)Aa (1.00±0)Cc (1.00±0)Bc 1(1.10±0.17)Aa(10.37±2.36)BCbc(5.56±0.63)Aa3(1.13±0.13)Aa(44.69±4.96)Aa(2.88±0.50)ABbc6(0.82±0.09)Aa(7.10±1.20)BCc(1.05±0.15)Bc12(0.82±0.09)Aa(11.02±2.10)BCbc(1.57±0.29)Bbc24(0.36±0.06)Aa(26.16±1.68)ABb(3.42±0.76)ABb48(0.43±0.19)Aa(17.01±3.58)BCbc(0.99±0.16)Bc

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.05水平上差異顯著；同列不同大寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.01水平上差異極顯著。

表4 低溫脅迫處理下細(xì)葉百合LpNAC13在其根、鱗莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平

時(shí)間/h根鱗莖葉0(1.00±0)Bbc (1.00±0)Aa (1.00±0)Aa 1(1.55±0.13)Bbc(0.48±0.02)Bb(0.05±0.01)CDd3(3.10±1.22)Bb(0.32±0.08)BCDcd(0.16±0.02)Bb6(12.27±1.87)Aa(0.25±0.05)CDd(0.09±0.02)Cc12(0.07±0.01)Bc(0.33±0.02)BCDcd(0.02±0.01)Dd24(0.06±0.01)Bc(0.20±0.04)Dd(0.04±0.01)Dd48(0.29±0.02)Bc(0.44±0.05)BCbc(0.03±0)Dd

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.05水平上差異顯著；同列不同大寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.01水平上差異極顯著。

NaCl誘導(dǎo)下：根中，LpNAC13相對(duì)表達(dá)量在48 h內(nèi)均高于對(duì)照，整體呈上調(diào)趨勢(shì)，且在6 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的15.78倍；鱗莖中：LpNAC13相對(duì)表達(dá)量在前3 h緩慢上升，6 h開(kāi)始迅速下降，24 h又開(kāi)始迅速上升，且在48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的25.69倍，整體變化幅度非常大，對(duì)鹽脅迫極其敏感；在葉片中，LpNAC13相對(duì)表達(dá)量在48 h內(nèi)均高于對(duì)照，整體呈上調(diào)趨勢(shì)，且在在48 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照組的7.06倍。

表5 NaCl脅迫處理下細(xì)葉百合LpNAC13在其根、鱗莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平

時(shí)間/h根鱗莖葉0(1.00±0)Bb (1.00±0)Ee (1.00±0)Gg 1(2.01±0.20)Bb(1.86±0.06)Dd(1.54±0.28)Ff3(1.33±0.25)Bb(2.24±0.09)Cc(3.29±0.14)Ee6(15.78±1.73)Aa(0.70±0.09)Ff(4.32±0.50)Cc12(10.90±1.41)ABa(0.65±0.20)Ff(4.79±0.13)Bb24(2.86±0.72)Bb(10.63±2.81)Bb(4.06±0.22)Dd48(1.92±0.06)Bb(25.69±1.68)Aa(7.06±0.19)Aa

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.05水平上差異顯著；同列不同大寫(xiě)字母表示不同處理在P<0.01水平上差異極顯著。

總之，經(jīng)ABA、干旱、低溫和高鹽處理后，LpNAC13表達(dá)量在根，鱗莖，葉片均發(fā)生改變，初步證實(shí)LpNAC13是可被逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，且在不同植物組織發(fā)育過(guò)程中所起作用存在一定差異。

3 討論與結(jié)論

NAC蛋白作為植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其N(xiāo)末端是由約150個(gè)氨基酸殘基組成的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A～E)[31]，而其C末端是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可以決定NAC蛋白的不同功能[32]。本研究從細(xì)葉百合克隆得到1個(gè)新的基因LpNAC13，其N(xiāo)末端存在一個(gè)高度保守的NAM域，由此推斷LpNAC13屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員。

已有研究表明同一亞類(lèi)基因大都具有功能相似的特點(diǎn)，從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出細(xì)葉百合LpNAC13轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥NAC083在同一枝進(jìn)化樹(shù)上，親緣關(guān)系較近，可能屬于SENU5亞類(lèi)，而SENU5亞類(lèi)中的大多數(shù)NAC基因都與植物響應(yīng)環(huán)境脅迫有關(guān)[32]；相關(guān)研究表明，NAC083作為ABA應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控COR/RD基因以延緩葉片衰老來(lái)提高耐鹽性。而COR15A/B和RD29A/B基因作為公認(rèn)的參與非生物脅迫反應(yīng)的標(biāo)記基因，其啟動(dòng)子中具有如對(duì)干旱、高鹽和滲透脅迫等多種應(yīng)激信號(hào)反應(yīng)的順式作用元件，可以被NAC083轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)直接結(jié)合其啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)[29，33-35]。因此，推測(cè)LpNAC13很可能參與細(xì)葉百合中高鹽等逆境脅迫調(diào)控。為了進(jìn)一步證明上述推測(cè)，對(duì)細(xì)葉百合進(jìn)行非生物脅迫處理，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)LpNAC13在ABA、PEG、2 ℃低溫與NaCl脅迫誘導(dǎo)下，其表達(dá)模式不盡相同且具有時(shí)空和組織表達(dá)特異性，表明LpNAC13具有參與調(diào)控細(xì)葉百合應(yīng)答上述四種非生物脅迫的作用，且在細(xì)葉百合的根、鱗莖和葉片中的應(yīng)答脅迫分子機(jī)制可能存在差異。這類(lèi)似于其他抗逆境脅迫相關(guān)NAC基因在逆境脅迫中的表達(dá)模式不盡相同且具有時(shí)空和組織表達(dá)特異性。如，甜橙(Citrussinensis)CsNAC1能響應(yīng)低溫、高鹽和ABA脅迫，其中，在ABA誘導(dǎo)時(shí)，CsNAC1表達(dá)量變化趨勢(shì)沒(méi)有明顯規(guī)律，而在低溫、高鹽脅迫時(shí)表達(dá)量整體呈逐漸上升趨勢(shì)且在葉中較為優(yōu)先表達(dá)[36]；茄子(Solanummelongena)SmNAC1在受到低溫和高鹽誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，且在根中優(yōu)先表達(dá)[37]；毛白楊(Populustrichocarpa)PtoNAC157在受到低溫、高鹽、干旱和ABA脅迫后，在幼根、莖和葉中均有表達(dá)，且在莖中的表達(dá)量最高[38]；紫花苜蓿MsNAC2在ABA、干旱、低溫和高鹽脅迫誘導(dǎo)下顯著升高，并且MsNAC2在根中的表達(dá)量要明顯高于在葉中的表達(dá)量[18]；小黑楊(Populussimonii×P.nigra)NAC7在鹽脅迫誘導(dǎo)下主要在根中表達(dá)，而在莖和葉中的表達(dá)卻很少[39]。由此表明LpNAC13可能同上述逆境響應(yīng)調(diào)控基因一樣，參與逆境響應(yīng)，為后續(xù)深入研究細(xì)葉百合分子育種提供有效的依據(jù)。