王樹琪 李華 唐中生

摘要：目的 從人外周血獲取單核細(xì)胞，并利用GPS將其誘導(dǎo)分化為DCs，研究GPS對DCs分化成熟、表型的影響。方法 密度梯度離心法及細(xì)胞貼壁法獲取人外周血單核細(xì)胞;對不同分組（細(xì)胞因子組、甘草多糖組、聯(lián)合組）的單核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng);倒置相差顯微鏡、瑞氏-姬姆薩染色法觀察各組DCs形態(tài)變化;Western Blot對比各組DCs標(biāo)志物蛋白表達(dá)差異。結(jié)果 各組單核細(xì)胞體外培養(yǎng)均可誘導(dǎo)為DCs，符合DCs形態(tài)學(xué)特征，以聯(lián)合組數(shù)量最多、體積最大、突起最顯，細(xì)胞染色強(qiáng)于它組;Western Blot顯示各組細(xì)胞標(biāo)志物蛋白（CD80、CD40、CD83、CD86）均符合DCs表型特征，并隨細(xì)胞成熟而表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)量以聯(lián)合組最明顯。結(jié)論 GPS可誘導(dǎo)DCs的分化成熟，且協(xié)同細(xì)胞因子效果更佳。這為進(jìn)一步從DCs角度探討GPS增強(qiáng)人體免疫和抗腫瘤機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞;甘草多糖;單核細(xì)胞;分化成熟;表型

中圖分類號：R285 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2020）02-0072-07

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作為目前功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），它能攝取各類抗1-3原，在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫調(diào)控中均起著重要作用。因此，從DCs角度來制備相應(yīng)的抗腫瘤疫苗是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)[1]。DCs在人體內(nèi)含量甚微，僅占外周血單核細(xì)胞的1%左右，因此體外培養(yǎng)和擴(kuò)增DCs對制備抗腫瘤DCs疫苗具有重要意義。尋找合適的DCs前體細(xì)胞來源，體外誘導(dǎo)分化以獲得足量DCs來制備疫苗是DCs抗腫瘤治療的前提和關(guān)鍵。國內(nèi)外眾多人員從中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤的角度開展了很多研究，發(fā)現(xiàn)許多中藥多糖可誘導(dǎo)DCs在體外的分化成熟，同時，在一定程度上呈劑量依賴性。甘草多糖（Glyeyrrhiza polysaeeharide，GPS）為中藥甘草的重要有效成分，主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，具有多方面的生物活性。藥理研究發(fā)現(xiàn)[2]，GPS具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、防止骨關(guān)節(jié)炎等作用，而且具有無細(xì)胞毒性的特點(diǎn)。GPS能夠提高人體免疫和抑制腫瘤生長，但其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。DCs的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，為GPS免疫抗腫瘤的機(jī)制提供了新的視角，即GPS抗腫瘤的機(jī)制是否與DCs的增殖、成熟和表型以及功能的改變有關(guān)，其誘導(dǎo)成熟的DCs是否具有刺激T細(xì)胞增殖的能力，以及與經(jīng)典細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DCs在功能上有何區(qū)別等？明確GPS與DCs之間的相互作用，從而為GPS應(yīng)用于臨床抗腫瘤和制備相關(guān)抗腫瘤疫苗提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)研究支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用人外周血 新鮮人外周濃縮白細(xì)胞血：由貴州省血液中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 甘草多糖：純度>90%，購自南京景竹生物科技有限公司，批號15020609。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素4（rhIL-4）、重組人干擾素α（rhTNF-α）：美國PeproTech公司;淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，D=1.077 g/mL）：達(dá)可為生物技術(shù)有限公司;快速瑞氏-姬姆薩染液試劑盒：南京建成生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒、一步法快速WB試劑盒、抗β-Actin單克隆抗體、蛋白膜印跡再生液：北京康為生物技術(shù)有限公司;鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人CD80、鼠抗人CD40：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.4 儀器和設(shè)備 CJ-1D型超凈臺：天津泰斯特公司;TS-100F型倒置相差顯微鏡：日本尼康公司;CUSA31311型CO2培養(yǎng)箱：美國Napco公司;MSL-3020型三洋全自動45171008型低溫高速離心機(jī)：湖南長沙湘儀公司;TC20型細(xì)胞計數(shù)儀、Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、164-5050型電泳儀、Mini-PROTEAN型蛋白電泳槽：美國Bio-Rad公司;LIDE20型掃描儀：日本佳能公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 ?單核細(xì)胞的分離及imDCs、mDCs的獲取 取新鮮人外周濃縮白細(xì)胞血40 mL，加入1倍體積RPMI1640培養(yǎng)液，1：1稀釋鋪于淋巴細(xì)胞液面上（淋巴細(xì)胞分離液與稀釋濃縮白細(xì)胞血比例為1：2），以室溫，1800 rpm，18 min進(jìn)行離心。吸取白膜層獲得單個核細(xì)胞，并加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液后，以室溫、1000 rpm，10 min進(jìn)行離心。棄去上清，根據(jù)混濁度重復(fù)1-2次。以適量RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，加入到75 cm3培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～3 h貼壁，即為單核細(xì)胞。

將細(xì)胞濃度調(diào)至5×105/mL，平均分為3組。A細(xì)胞因子組：加入rhGM-CSF液（終濃度為1000 U/mL）、rhIL-4液（終濃度為500 U/mL）;B甘草多糖組：加入甘草多糖液（終濃度為400μg）。C聯(lián)合組：加入rhGM-CSF液（終濃度為1000 U/mL）、rhIL-4液（終濃度為500 U/mL）及甘草多糖液（終濃度為400 μg）。入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)5天，第3天培養(yǎng)基半換液，即可誘導(dǎo)為imDCs。各組imDCs 加入rhTNF-α（終濃度為50 U/mL）培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)3天，即可將 imDCs誘導(dǎo)成熟。

2.1.2 瑞氏-姬姆薩染色 取無菌24孔培養(yǎng)板，以多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，烘干清洗后照射紫外殺菌。將各組DCs細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h使細(xì)胞貼壁，之后加入4%多聚甲醛固定液用以固定。最后使用快速瑞氏-姬姆薩染液試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色。

2.1.3 免疫印跡法檢測 使用細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒提取膜蛋白，以4℃，14000轉(zhuǎn)離心5 min，收集上清即為細(xì)胞膜蛋白溶液。用酶標(biāo)儀在562 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)品液和各組細(xì)胞膜蛋白液的吸光值，并做好記錄。對照本實(shí)驗(yàn)的蛋白分子量制作分離膠與濃縮膠，按預(yù)定上樣順序各樣本各20 μL加入泳道，并將上樣順序記錄。設(shè)置電泳條件，開始電壓強(qiáng)度為80 V，電泳時間為30 min，電泳至整個條帶進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到120 V，穩(wěn)壓繼續(xù)電泳，待預(yù)染蛋白質(zhì)Marker條帶分離清晰時停止電泳。電泳結(jié)束后低溫轉(zhuǎn)膜2 h。取下轉(zhuǎn)好的PVDF膜，使用一步法快速WB（HRP）試劑盒說明進(jìn)行操作。將各組PVDF膜放入蛋白膜印跡再生液中再生，并按說明進(jìn)行內(nèi)參處理。每個目的蛋白條帶及內(nèi)參條帶做3次，曝光后得照片用掃描儀掃描，經(jīng)Gelpro32 圖像軟件分析讀取灰度值，應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行處理，比較各組目的蛋白的表達(dá)情況。

2.1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 19.0軟件完成，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）為表示方式，采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本文柱狀圖使用專業(yè)制圖軟件：GraphPad Prism軟件制作。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單核細(xì)胞的獲取 每40mL 新鮮人外周血濃縮白細(xì)胞可獲得1.5×107個單核細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察單核細(xì)胞呈圓形貼壁生長，表面光滑，細(xì)胞核多位于中央呈圓形。可見計劃用于各組的單核細(xì)胞無明顯差異可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，見圖1。

2.2.2 imDCs細(xì)胞的獲取與鑒定

2.2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察 各組imDCs生長狀態(tài)良好，有懸浮現(xiàn)象，體積較單核細(xì)胞增大，大小不等，形態(tài)不規(guī)則，胞體較大的可見少量突起。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)B組與C組細(xì)胞數(shù)量較A組有所增加，C組增多明顯，見圖2。

2.2.2.2 瑞氏-姬姆薩染色觀察 各組imDCs體積增大，大小不等，形態(tài)不規(guī)則呈多邊形，可見毛刺樣突起，細(xì)胞核偏位多為圓形，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)紫色。其中B組與C組的細(xì)胞數(shù)量較A組多而聚集，C組最明顯，見圖3。

2.2.2.3 Western Blot法檢測imDCs標(biāo)志物蛋白的表達(dá)情況 各組細(xì)胞均表達(dá)CD40、CD80、CD86，其中CD83各組表達(dá)不明顯，符合DCs在未成熟階段表達(dá)的特點(diǎn)，尤以聯(lián)合組表達(dá)量最高。

2.2.3 mDCs細(xì)胞的獲取與鑒定

2.2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察 各組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，多成懸浮生長，大小不等，可見較多細(xì)長的突起。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)B組與C組的細(xì)胞數(shù)量較A組有所增加，C組數(shù)量及突起增多較明顯（圖8）。

2.2.3.2 瑞氏-姬姆薩染色觀察 各組單核細(xì)胞按各自方式培養(yǎng)8天后行瑞氏-姬姆薩染色觀察，各組細(xì)胞突起變多，細(xì)胞核偏位，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)紫色。其中B組與C組的細(xì)胞數(shù)量及突起較細(xì)胞因子組多而密，C組最明顯（圖9）。

2.2.3.3 Western Blot法檢測mDCs標(biāo)志物蛋白的表達(dá)情況 各組標(biāo)志物隨著DCs成熟而表達(dá)增強(qiáng)，各組細(xì)胞均高表達(dá)CD40、CD80、CD86、CD83，符合DCs在成熟階段表達(dá)的特點(diǎn)，尤以聯(lián)合組表達(dá)最明顯。

3 討論

中藥甘草有“中藥之王”之美譽(yù)，在中藥的地位無法形容，其橫貫中醫(yī)方劑90%，又有“十方九草”之說，可謂為中藥之寶。從中醫(yī)理論出發(fā)認(rèn)為甘草性味甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)氣健脾益、清熱解毒、止咳化痰、緩?fù)粗辜?、調(diào)和藥性等作用;主治心氣不足證，脾氣虛證，咳喘癥，脘腹、四肢攣急痛癥，以及熱毒瘡瘍、咽喉腫痛、藥食中毒等癥。大量實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了甘草具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤的作用。隨著中藥甘草藥理成分的深入研究，GPS作為甘草重要的有效成分，因其是一種對正常細(xì)胞無毒副作用免疫調(diào)節(jié)劑，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多途徑調(diào)節(jié)作用，故越來越受到重視。筆者就是基于中藥甘草及其主要成分GPS調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的這一作用特點(diǎn)，與在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用且功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞DCs結(jié)合起來，為進(jìn)一步探討中藥甘草及GPS調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等作用的藥理機(jī)制提供理論依據(jù)。

DCs主要由CD34+造血干細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞產(chǎn)生，存在于人骨髓、臍血和成年人外周血中。骨髓獲取痛苦，臍血來源不便，而外周血獲取DCs操作簡單，且以外周血單核細(xì)胞作為前體細(xì)胞誘導(dǎo)的DCs相對純度比較高[4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[3]以臍血單核細(xì)胞為前體細(xì)胞，分別以200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL GPS懸液誘導(dǎo)DCs，發(fā)現(xiàn)以400μg/mL GPS組誘導(dǎo)DCs數(shù)量最多，最具形態(tài)學(xué)特征，此結(jié)果顯示GPS可體外促進(jìn)臍血單核細(xì)胞分化與成熟為DCs，并確定了最佳濃度。本實(shí)驗(yàn)通過加以改進(jìn)的密度梯度離心法、細(xì)胞培養(yǎng)貼壁法，每40mL 新鮮人外周血濃縮白細(xì)胞可獲得1.5×107個單核細(xì)胞。

多種細(xì)胞因子組合可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成熟為DCs。經(jīng)典的培養(yǎng)DCs的細(xì)胞因子組合是GM-CSF、IL-4，其中GM-CSF可促進(jìn)髓系單核細(xì)胞、粒細(xì)胞發(fā)育，誘導(dǎo)DCs前體擴(kuò)增分化，是DCs生成發(fā)育的根本因子;IL-4可抑制髓系向粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分化，誘導(dǎo)DCs生長和成熟[5-6]。在此基礎(chǔ)上加入TNF-α可進(jìn)一步阻止粒系的分化而刺激DCs的成熟，并增強(qiáng)其抗原提呈能力，故TNF-α是DCs成熟的一種重要因子[7-8]。同時TNF-α作為第一信號而作用于DCs整個發(fā)育過程，特別是DCs早期生成的必須因子，可上調(diào)GM-CSF受體水平，進(jìn)一步促進(jìn)DCs前體細(xì)胞增殖與分化，且能保護(hù)DCs免于自發(fā)凋亡[9-10]。故我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計也選用經(jīng)典因子組合作為對照及聯(lián)合培養(yǎng)組，結(jié)果顯示甘草多糖組與經(jīng)典因子組細(xì)胞形態(tài)相比無明顯變化，均符合樹突狀細(xì)胞各階段的形態(tài)學(xué)特征，并且聯(lián)合組的DCs細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞體積、細(xì)胞突起等，均明顯優(yōu)于它組。說明甘草多糖可以直接促進(jìn)單核細(xì)胞分化為imDCs，并可促進(jìn)其分化成熟，協(xié)同細(xì)胞因子可使DCs數(shù)量增多，更具DCs形態(tài)學(xué)特征，且其細(xì)胞狀態(tài)更佳。

外周血單核細(xì)胞來源的imDCs低表達(dá)CD40、CD80、CD86，CD83不表達(dá)或表達(dá)不穩(wěn)定;而DCs高表達(dá)CD40、CD80、CD86，以及CD83;故本次實(shí)驗(yàn)選取這幾個特異性的表面分子來觀察甘草多糖對DCs表型的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)Western blotting檢測結(jié)果顯示：各組imDCs細(xì)胞均表達(dá)CD40、CD80、CD86，符合DCs在未成熟階段表達(dá)的特點(diǎn)，其中CD83各組表達(dá)不明顯，這與CD83作為成熟DCs的標(biāo)志分子而在未成熟階段表達(dá)不穩(wěn)定相符;各組DCs細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后CD40、CD80、CD86的表達(dá)量均有上調(diào)，且高表達(dá)CD83，符合DCs在成熟階段表達(dá)的特點(diǎn)。各組對比DCs標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無論處于未成熟還是成熟階段，尤以聯(lián)合組表達(dá)最強(qiáng)，特別是在成熟后聯(lián)合組對CD86、CD80、CD40的表達(dá)與其它2組相比均有顯著差異（P<0.05），但因子組與多糖組相比無明顯差異，CD86、CD80、CD40與T細(xì)胞的活化增殖、細(xì)胞因子的分泌及免疫功能的增強(qiáng)有密切關(guān)系，說明聯(lián)合組DCs的免疫功能明顯強(qiáng)于因子及多糖組，而GPS誘導(dǎo)的DCs與經(jīng)典細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DCs相比在其表型的表達(dá)及免疫功能方面無較大差異。這一結(jié)果證實(shí)了GPS可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分化成熟為DCs，且協(xié)同細(xì)胞因子誘導(dǎo)效果更佳，為我們以后獲得DCs提供了簡便、經(jīng)濟(jì)的方法。

從本課題實(shí)驗(yàn)可以看出，GPS能誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分化成熟為DCs，且協(xié)同細(xì)胞因子可使DCs數(shù)量增多，更具DCs形態(tài)學(xué)特征，且其細(xì)胞狀態(tài)更佳。此研究結(jié)果說明中藥甘草及GPS增強(qiáng)免疫、抗腫瘤的機(jī)制可能與影響DCs細(xì)胞增殖、分化成熟、表型以及功能有關(guān)。

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（收稿日期：2019-10-28）