董振香，顧秋亞，李丹晨，孫馳翔，余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

魔芋作為食品和傳統(tǒng)藥材在中國(guó)，日本，東南亞廣泛種植。魔芋中75%的水溶性纖維多糖是魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan, KGM)，一般認(rèn)為，魔芋葡甘露聚糖是由β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖以1∶1.69或1∶1.6 的比例通過(guò)β-1,4糖苷鍵鏈接而成相對(duì)分子質(zhì)量在20萬(wàn)～200萬(wàn)的復(fù)合多糖[1-2]。KGM及其衍生物不能被人類腸道上表皮細(xì)胞的酶直接水解，因此KGM被認(rèn)為是難消化的食用纖維[3]。天然魔芋膠分子質(zhì)量過(guò)大，黏度高、溶解度小，使得KGM 的應(yīng)用受到了限制，所以將天然 KGM 降解成魔芋低聚糖的研究成為熱點(diǎn)。

魔芋低聚糖(konjac oligosaccharides, KOGM)是指通過(guò)酶解、酸解、輻射等方法使天然魔芋葡甘露聚糖降解而得到的2～10個(gè)單糖單位組成的功能性低聚糖[4]。研究表明魔芋低聚糖具有促進(jìn)腸道有益菌的增殖[5-6]；抑制淀粉老化，清除自由基，抑制致病菌的生長(zhǎng)[7]；保持腸道菌群平衡，改善腸道功能，保持腸黏膜緊密完整，提高機(jī)體免疫[8]；減少盲腸內(nèi)游離氨的含量[9]；降低膽固醇[10]；預(yù)防和治療痤瘡等功效[11]。

不同分子質(zhì)量魔芋低聚糖具有的不同結(jié)構(gòu)和功效，侯占偉等[12]對(duì)不同分子質(zhì)量的魔芋甘露聚糖黃酰化證明分子質(zhì)量在10 kDa～30 kDa時(shí)抗凝血性，抗腫瘤，抑菌效果最好；YOSHIMURA等[13]研究表明2.56×105，4.38×105，4.44×105，9.6×105四種不同分子質(zhì)量KOGM相同條件下分子質(zhì)量越大凝膠速度越快且凝膠的彈性模量和儲(chǔ)能模量越大；陳琴音等[14]利用纖維素酶和半纖維素酶酶解，經(jīng)處理后得到分子質(zhì)量為2 kDa～3 kDa(藥用特定分子質(zhì)量)的魔芋低聚糖；SONG等[15]乙?；幚砻附夂蟮哪в蟮途厶遣⑼ㄟ^(guò)硅膠柱分離純化后去乙酰化得到甘露糖-葡萄糖-半乳糖，摩爾比為2∶1∶1的甘露三糖，對(duì)其進(jìn)行ACE抑制活性試驗(yàn)表明，P3對(duì)ACE也具有一定的抑制活性。目前少有報(bào)道單一聚合度功效差異比較，因此，探究不同分子質(zhì)量魔芋葡甘露聚糖的抗氧化活性以及對(duì)腸道有益菌的促進(jìn)生長(zhǎng)作用具有重要意義，為特異性切割特定功能低聚糖提供指導(dǎo)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用自主構(gòu)建的畢赤酵母產(chǎn)耐高溫β-甘露聚糖酶對(duì)魔芋膠進(jìn)行水解，通過(guò)控制水解條件得到低聚糖最高水解率為43.56%的樣品，采用透析，超濾等分離技術(shù)得到不同分子質(zhì)量KGM樣品。比較不同分子質(zhì)量KGM功能性差異。采用ORAC法比較不同樣品抗氧化活性，并進(jìn)行6種乳酸菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程的延滯期和ΔOD以及發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)乳機(jī)酸含量。為進(jìn)一步探究乳酸菌對(duì)魔芋低聚糖的代謝利用機(jī)制以及特異性切割功能性聚合度益生元糖苷酶的改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A，由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；乳酸菌L.acidophilus，L.rhamnosus，L.bulgaricus，P.acidilactici,E.lactis,E.faecium由作者實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室提供；魔芋粉，購(gòu)自武漢靖江魔芋制品有限公司；D-甘露糖、 瓜兒豆膠，購(gòu)自阿拉丁；蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，葡萄糖，CH3COONa、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、 CaCO3、正丁醇、檸檬酸氫二銨、乙酸、 3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、Na2SO3、NaOH等，分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；透析袋，上海橋星貿(mào)易有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸取物10.0，酵母提取液5.0，葡萄糖5.0，CH3COONa 5.0，檸檬酸氫二銨2.0，吐溫80 1.0， K2HPO42.0， MgSO4· 7H2O 0.2， MnSO4·7H2O 0.05， pH 6.2～6.4，sMRS培養(yǎng)基為不添加碳源MRS培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

G180T滅菌鍋，美國(guó)致微儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 魔芋膠溶液的制備[16]：

取1.00 g魔芋膠溶于100 mL pH 5.5的乙酸鈉緩沖液，25 ℃ 500 r/min 條件下磁力攪拌30 min，制成魔芋膠溶解液KGM樣品。

1.4.2 魔芋酶解液樣品的制備

1.4.2.1 魔芋膠的酶解[17]

用重組畢赤酵母菌產(chǎn)甘露聚糖酶水解魔芋膠得到魔芋低聚糖。控制酶解條件為：底物質(zhì)量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃條件下水解，每隔10 min取樣立即煮沸，10 000 r/min 離心10 min，取上清用DNS法測(cè)定還原糖的含量并計(jì)算水解率。

1.4.2.2 酶解產(chǎn)物的定性和定量分析

隨著酶解時(shí)間的加長(zhǎng)，水解程度越來(lái)越高，得到具有不同水解度的樣品。通過(guò)薄層層析法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行定性半定量檢測(cè)。展開劑：V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)= 4∶4∶3，顯色劑：Orcinol， 115 ℃下顯色5 min[18]。樣品經(jīng)0.2 kDa透析袋處理24 h除去樣品中單糖，通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行水解液成分的定量分析，色譜條件為色譜柱：Agilent ZORBAX-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=65∶35； 流速：1 mL/min； 柱溫：35 ℃； 進(jìn)樣量：15 μL; 檢測(cè)器：RID檢測(cè)器[19]。

1.4.2.3 不同分子質(zhì)量KGM樣品制備

樣品經(jīng)0.2 kDa透析袋處理24 h除去樣品中單糖和小分子鹽得到樣品KOGMI，KOGMI經(jīng)5 kDa超濾管離心得到相對(duì)分子質(zhì)量大于5 000的截留樣品KOGMII以及分子質(zhì)量小于5 000的透過(guò)液，透過(guò)液經(jīng)3 kDa超濾管超濾得到樣品分子質(zhì)量為3 000～5 000的截留樣品KOGMIII，以及小于3 000的透過(guò)樣品KOGMIV，將各樣品濃縮后凍干保存。

1.4.3 魔芋膠水解液的相對(duì)分子質(zhì)量(MW)分布

取凍干保存的樣品用水復(fù)溶配成2 mg/mL樣品溶液，樣品過(guò)0.22 μm濾膜，高效液相法檢測(cè)樣品的各分子質(zhì)量分布。色譜條件為色譜柱：Waters UltrahydrogelTMLlnear (7.8 mm×300 mm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3溶液；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

1.4.4 不同聚合度魔芋低聚糖功能性差異

1.4.4.1 ORAC法測(cè)定抗氧化活性

使用氧自由基吸收能力-熒光素(ORAC-FL)測(cè)試估計(jì)總抗氧化能力，向96孔(黑)板各孔加入25 μL空白(PBS)和不同濃度(3.125、6.250、12.50、25、50、75 μmol/L)Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品用75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，每孔加入150 μL FL(4×10-3mmol/L)溶液，37 ℃ 孵育10 min，然后迅速向每個(gè)孔中加入25 μL AAPH(153 mmol/L)?？刂萍ぐl(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)535 nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，每90 s測(cè)定1次各孔熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間一般設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止，約91次循環(huán)[20]。根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各樣品以Trolox當(dāng)量(TE)計(jì)的自由基吸收能力，結(jié)果以μmol TE/g表示。測(cè)定結(jié)果以O(shè)RAC值表示，得到所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件處理，計(jì)算各樣品ORAC值。[21]

計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：f0，第1次熒光讀數(shù)；fi，第i次熒光讀數(shù)；AUC0，空白液熒光衰減下的面積；AUC1，Trolox標(biāo)準(zhǔn)液熒光衰減下的面積；AUC2，樣品熒光衰減下的面積；CTrolox，Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的摩爾濃度，μmol/L；C樣，樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.4.4.2 乳酸菌菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[16]

將細(xì)菌菌株從冷凍原液(20%甘油，體積分?jǐn)?shù))中接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃厭氧生長(zhǎng)12 h。將1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至3 mL含10 g/L葡萄糖的sMRS(s MRS不含碳源培養(yǎng)基)肉湯中，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)生物量OD600=0.8時(shí)，取2 mL菌液于離心管中12 000 r/min 離心5 min，用1 mL pH 7.4的PBS(磷酸鹽)緩沖液重懸12 000 r/min，5 min離心洗滌2次。將PBS洗滌過(guò)的菌球用2 mL sMRS培養(yǎng)基重懸。

分別吸取125 μL重懸菌液于無(wú)菌潔凈的96孔板中，加入125 μL 2%糖樣品作為唯一碳源供乳酸菌菌體生長(zhǎng)并向孔內(nèi)添加50 μL無(wú)菌礦物油，將孔板放置37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每隔30 min測(cè)量乳酸菌OD600，每次測(cè)量前添加板振蕩30 s，每種碳水化合物進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4.3 乳酸菌產(chǎn)有機(jī)酸的測(cè)定

將乳酸菌發(fā)酵48 h培養(yǎng)液于12 000 r/min，5 min離心獲得上清，準(zhǔn)確吸取2 mL發(fā)酵液上清，分別加入800 μL硫酸鋅(300 g/L)和800 μL亞鐵氰化鉀(106 g/L)，振蕩混勻，離心。上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后通過(guò)HPLC檢測(cè)，檢測(cè)條件為色譜柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4，用磷酸調(diào)pH=2.7；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋膠的酶解

控制底物質(zhì)量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃反應(yīng)條件下每隔10 min取樣，樣品水解率隨時(shí)間變化如圖1所示，在0～50 min酶解反應(yīng)迅速，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)樣品水解率不斷增大，在50～70 min水解率變化趨于平穩(wěn)，其中酶解反應(yīng)50 min時(shí)樣品水解程度達(dá)到44.26%。

圖1 魔芋膠水解率隨時(shí)間的變化曲線Fig.1 The curve of the degree of hydrolysis of konjac gum with time

2.2 魔芋膠水解產(chǎn)物的定性定量分析

不同水解時(shí)間酶解產(chǎn)物進(jìn)行TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。隨反應(yīng)不斷進(jìn)行，魔芋膠水解率不斷增加，高聚合度糖在不斷減少，低聚合度三糖二糖單糖的含量在不斷增加，且水解后存在G-G，M-M，M-G，M-M-M，M-G-G，M-M-G等多種不同聚合形式的單糖聚合體。對(duì)水解樣品經(jīng)過(guò)透析和超濾分離后經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。水解60 min后各聚合度低聚糖分布均勻，二糖含量23.65%，三糖27.76%，四糖28.08%，五糖11.72%，六糖8.79%，選用酶解60 min水解率為43.56%的樣品進(jìn)行后續(xù)的樣品準(zhǔn)備分析。

圖2 不同水解時(shí)間酶解產(chǎn)物的TLC圖Fig.2 TLC diagram of enzymatic hydrolysis products at different hydrolysis times

圖3 酶解產(chǎn)物組分的 HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of enzymatic product components

2.3 酶解產(chǎn)物樣品聚合度分析

目前報(bào)道的KGM重均分子質(zhì)量在1×104～2×106[22]，通過(guò)酶解超聲等方式可以降低KGM的分子質(zhì)量[23]。本實(shí)驗(yàn)用不同分離方法得到KOGM樣品的GPC譜圖如圖4所示，從上到下依次為KGM，KOGMI， KOGMII，KOGMIII，KOGMIV。

圖4 不同KOGM樣品GPC譜圖Fig.4 GPC spectra of different KOGM samples

樣品的Mn，Mw及PDI如表1所示，酶解后魔芋膠分子質(zhì)量大幅度降低，相對(duì)分子質(zhì)量為1 306，經(jīng)3 kDa超濾管超濾得到樣品KOGMIV相對(duì)分子質(zhì)量最低為787，因此β-甘露聚糖酶水解KGM后超濾處理可快速有效地得到不同分子質(zhì)量聚合的魔芋甘露聚糖樣品。

表1 凝膠滲透色譜法(GPC)測(cè)定魔芋樣品的相對(duì)分子質(zhì)量Table 1 Relative molecular weights of konjac samples as determined by gel permeation chromatography(GPC)

2.4 不同分子質(zhì)量KOGM功能性分析

2.4.1 ORAC法測(cè)定抗氧化活性

以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，凈面積為縱坐標(biāo)計(jì)算并繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=0.262 7x+22.134，R2=0.998 1。ORAC法測(cè)定不同分子質(zhì)量KOGM的抗氧化活性(n=6)如表2所示，同一濃度條件下，KOGMIII樣品(1.033 3 mg/mL)ORAC值最高，為870.303 7 μmol Trolox當(dāng)量/g，水解后的魔芋低聚糖均具有一定的抗氧化活性，其中相對(duì)分子質(zhì)量在3 000～5 000 KOGMIII抗氧化活性最高，是甘露糖的58.2倍，是葡萄糖的95.93倍。

2.4.2 酶解產(chǎn)物的乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室保藏的6株微生態(tài)飼料添加有益乳酸菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象以不同糖樣品為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，以葡萄糖、甘露糖、菊粉、KGM作為對(duì)照，5種不同分子質(zhì)量魔芋低聚糖為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，生長(zhǎng)情況如圖5所示。由圖5-A得出除L.bulgaricus外，菌體代謝利用低聚糖樣品的速度相比代謝葡萄糖略慢。但圖5-B和圖5-C顯示，菌體代謝低聚糖使得菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，且菌體利用低聚糖樣品最終生物量ΔOD普遍高于代謝利用葡萄糖、甘露糖單糖，且KOGMIV的樣品促進(jìn)生長(zhǎng)作用最明顯。高效液相檢測(cè)發(fā)酵液中乳酸的含量，如圖6所示，乳酸菌發(fā)酵KOGMIV發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)乳酸含量最高。

表2 ORAC法測(cè)定不同分子量KOGM的抗氧化活性(n=6)Table 2 ORAC method for determination of antioxidant activity of different molecular weight KOGM (n=6)

A-乳酸菌生長(zhǎng)延滯期；B-乳酸菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；C-乳酸菌正常ΔOD圖5 六種乳酸菌發(fā)酵不同魔芋甘露聚糖樣品(n=3)Fig.5 Growth of different konjac mannan samples fermented by six types of lactic acid bacteria

圖6 六種乳酸菌發(fā)酵不同樣品生成乳酸的含量Fig.6 Contents of lactic acid produced by fermentation of six lactic acid bacteria in different samples

3 結(jié)論

魔芋甘露聚糖可以通過(guò)物理法化學(xué)法以及酶法水解制成不同分子質(zhì)量聚合度的低聚糖[24]，然而不同方法得到的不同聚合度低聚糖結(jié)構(gòu)和功效差異性較大[25]。因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究酶法制備的不同分子質(zhì)量魔芋甘露聚糖抗氧化活性以及對(duì)乳酸菌促進(jìn)作用的差異。利用實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建保藏的畢赤酵母菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶解魔芋甘露聚糖，控制水解條件為：底物質(zhì)量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃條件下水解60 min得到水解率為43.56%的樣品，經(jīng)過(guò)除單糖以及不同孔徑超濾處理得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的樣品。對(duì)得到的樣品進(jìn)行抗氧化能力分析以及6種飼料添加有益乳酸菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量在3 000～5 000時(shí)魔芋甘露低聚糖抗氧化活性最高，6種乳酸菌均能利用魔芋甘露低聚糖作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，且相對(duì)分子質(zhì)量為787的低聚糖對(duì)乳酸菌促進(jìn)生長(zhǎng)效果最為顯著，且發(fā)酵結(jié)束后乳酸含量最高。為探究乳酸菌代謝魔芋低聚糖途徑以及定向切割特定聚合度低聚糖酶的改造提供依據(jù)。