張婷婷，梅銀柳，董萬法，王鏡勛，金 亮，吳 潔

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因藥學(xué)實驗室，南京 210009)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulceration colitic,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD),在西方國家較為常見，北美和歐洲分別有超過150萬和200萬人患病，近年來，隨著生活方式的改變，亞洲國家發(fā)病率逐年提高[1]。IBD發(fā)病機制不明，一般認為與環(huán)境因素、遺傳因素、腸道微環(huán)境和免疫因素等相關(guān)。目前IBD治療手段主要依賴手術(shù)切除和病癥緩解，但存在不良反應(yīng)強、易復(fù)發(fā)等缺點，因此尋找新的治療靶點是十分必要。

中性粒細胞是機體抵抗病原體入侵的第一道屏障，在固有免疫中發(fā)揮重要作用。2004年，研究人員發(fā)現(xiàn)中性粒細胞可通過一種新型方式達到殺滅病原體的作用——中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)，它是活化的中性粒細胞釋放核內(nèi)包括染色質(zhì)DNA在內(nèi)的核酸，并包裹自身胞質(zhì)顆粒蛋白酶所形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NETs在殺傷病原菌的同時也會對機體黏膜組織造成損傷，NETs的過度強盛或者不及時清除與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身性免疫疾病密切相關(guān)[3-4]。蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中有多種NETs成分蛋白[5]，另有研究發(fā)現(xiàn)對中性粒細胞蛋白如蛋白酶3(PR3)、髓過氧化物酶(MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白的抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)可成為IBD診斷和預(yù)后的生物標志物[6]，這些蛋白會在NETs形成過程中釋放并成為ANCA的來源[7-8]，從而增強機體免疫反應(yīng)，造成組織損傷。由此可見，NETs形成參與IBD疾病發(fā)展。

DNA是NETs主要的結(jié)構(gòu)成分，NETs抗原性也需DNA維持結(jié)構(gòu)完整性[9]，因此破環(huán)NETs的DNA骨架可以阻止其導(dǎo)致的異常自身免疫。國內(nèi)外也有多項研究證明，DNase可用于改善和治療因NETs增多而引發(fā)的疾病[10]。金黃色葡萄球菌分泌的葡萄球菌核酸酶(SNase)是一種具有磷酸二酯酶活性的單鏈蛋白，能迅速切割DNA和RNA長鏈形成的3′-核苷酸產(chǎn)物，且pH 4.8～9.2之間具有很好的酶活等優(yōu)點[11]。

乳酸菌(lactis acid bacteria，LAB)是公認的食品級安全菌，試驗表明，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)可以逃離胃酸的過度侵襲(存活率90%～98%)，并成功定植腸道，以乳酸乳球菌表達載體已逐漸成為口服疫苗的熱點[12]。本課題組前期構(gòu)建制備的重組乳酸菌L.lactispCYT:SNase可以穩(wěn)定表達SNase，并用于遞送基于自身抗原設(shè)計的重組蛋白疫苗[13]。前期的實驗結(jié)果表明：灌胃給予表達SNase的重組乳酸菌一方面可以穩(wěn)定定植于NOD小鼠腸道中并表達SNase蛋白[14]。在本次研究中將已表達SNase的重組乳酸菌灌胃給TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠，以探究其基于NETs降解而對小鼠腸道炎癥的保護機制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

5% TNBS水溶液(美國Sigma公司)；乳鏈菌肽(上海源葉生物科技有限公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(德國Oxoid公司)；M17肉湯粉(青島海博生物技術(shù)有限公司)；兔Ly6G抗體(美國Santa Cruz公司),兔citH3抗體(英國Abcam公司)；隱血試劑盒(上海雷根生物科技有限公司)；LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒(美國Biolegend公司)；TMB顯色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢艾瑞科生物科技有限公司)；SYBR Green Premix試劑盒(上海天根生物科技有限公司)，其他試劑均為市售化學(xué)或分析純。

1.2 儀 器

Spark多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；7300 Plus Real-Time PCR system、FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；數(shù)理切片掃描儀(日本Hamamatsu公司)；超聲破碎儀、LGJ-12冷凍干燥機、ZXZ-2型旋片式真空泵(臺州市博雯真空設(shè)備有限公司)；研磨儀(北京赫得科技有限公司)；MylabTMShaker SLST3(韓國Seoulin公司)。

1.3 菌 種

L.lactisNZ9000和L.lactispCYT:SNase均為本實驗室保存。

1.4 動 物

清潔級BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量20～22 g，購自上海西普兒-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2018-0006。所有動物實驗均符合動物倫理操作。

2 方 法

2.1 給藥乳酸菌L.lactis pCYT:SNase的制備

給藥乳酸菌L.lactispCYT:SNase的制備方法參見文獻[14]，即從保存的L.lactispCYT:SNase甘油管按照體積分數(shù)1%加到GM17培養(yǎng)基中30 ℃恒溫靜置過夜培養(yǎng)。次日按體積分數(shù)4%的接種量將活化的菌液轉(zhuǎn)接到GM17大瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當培養(yǎng)液A600達到0.5左右時加乳鏈菌肽(nisin)誘導(dǎo)培養(yǎng)，至A600達到1.2時停止培養(yǎng)。收集菌體，用無菌水對沉淀進行重懸，調(diào)整菌體濃度至2×1010CFU/mL。L.lactisNZ9000(以下簡稱NZ9000)同法培養(yǎng)和制備，但不加誘導(dǎo)劑。

2.2 TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立及給藥

小鼠清潔級環(huán)境下適應(yīng)飼養(yǎng)1周，實驗前按體質(zhì)量隨機分為4組：健康對照組(Control)、TNBS模型組(TNBS)、TNBS+NZ9000組(LL)、TNBS+L.lactispCYT:SNase組(LL-SNase);每組12只。造模前小鼠禁食不禁水24 h，4%水合氯醛按照10 μL/g 的劑量腹腔注射麻醉小鼠，用3.5F橡膠軟管甘油浸潤后從肛門緩慢插入4 cm處，按照100 mg/kg的劑量灌入5% TNBS水溶液加等體積乙醇的混合液，靜置30 s拔出，倒置5 min放回籠中，待其自然清醒。每天觀測小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及隱血狀況，根據(jù)表1的疾病活動指數(shù)(DAI)評分標準計算出每組小鼠的平均DAI分數(shù)[15]。給藥流程見圖1，具體為造模前3天提前乳酸菌灌胃給藥，每天1次，劑量均為每只4×109CFU。于第6天處死小鼠，分離結(jié)腸和脾臟，后續(xù)進行組織學(xué)分析。

Figure1 Schematic representation ofL.lactisadministration and induction of colitis in mice by 2.5%2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid(TNBS)

Table1 Disease activity index (DAI) score after TNBS induction in mice

ScoreBody weight loss/%Stool consistencyBleeding0<0NormalNegative11-5--26-10Loose stoolHemoccult positive311-15--4>15DiarrheaGross bleeding

2.3 結(jié)腸組織HE分析

分別取各組結(jié)腸于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋，制成5 μm切片，HE染色后，在顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜肌層結(jié)構(gòu)完整性、杯狀細胞數(shù)量、隱窩結(jié)構(gòu)及炎性細胞浸潤等情況，根據(jù)影響的程度對各組小鼠結(jié)腸組織進行評分[16]：無影響(0)、輕(1)、重(2)。每組最終評分為各項指標的平均數(shù)。

2.4 結(jié)腸組織MPO酶活測定

分別取各組結(jié)腸組織20 mg左右，加入生理鹽水研磨成10%的組織勻漿液，4 ℃,12 000 r/min離心15 min收集上清液，取10%結(jié)腸勻漿上清 10 μL 和TMB溶液100 μL，37 ℃反應(yīng)5 min，加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng)，于450 nm處測定吸收度。MPO相對酶活(U/g組織濕重)=(測定吸收度-對照吸收度)/取樣量(g)。

2.5 結(jié)腸組織QPCR檢測

稱取結(jié)腸組織50 mg，加入Trizol 500 μL，提取總RNA，定量后取2 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green進行擴增，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s循環(huán)1次，95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s循環(huán)40次。GAPDH作為每次擴增內(nèi)參，相對表達水平用2-ΔΔCt表示，引物序列見表2。

Table2 Sequences of real time PCR primers

GenePrimer sequences (5′→3′)GAPDHForward:CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGReverse:GTGGAATCTATTGGAACATGTTNF-ɑForward:CCTGTAGCCCACGTCGTAGReverse:GGGAGTAGACAAGGTACAACCCIL-1βForward:GAAATGCCACCTTTTGACAGTGReverse:TGGATGCTCTCATCAGGACAGIL-6Forward:CTGCAAGAGACTTCCATCCAGReverse:TCAGTGGTATAGACAGGTGTTGG

2.6 血清流式多細胞因子檢測

采用LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒，流式檢測血清與炎癥相關(guān)的炎性細胞因子。簡要流程為：標準品和血清稀釋樣本分別與磁珠室溫孵育2 h,加抗體后繼續(xù)室溫孵育1 h,加PE熒光標記的鏈霉親和素室溫孵育30 min,離心加緩沖液混懸上流式細胞儀檢測，用Legendplex軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.7 結(jié)腸組織免疫組化分析

各組石蠟包埋的結(jié)腸組織切成5 μm的切片，進行Ly6G和citH3抗體染色，用數(shù)字病理切片掃描儀進行掃描，Image Pro Plus軟件分析陽性信號。

2.8 統(tǒng)計分析

3 結(jié) 果

3.1 重組乳酸菌SNase表達的鑒定

如圖2所示，乳鏈菌肽誘導(dǎo)的工程菌L.lactispCYT:SNase能穩(wěn)定表達SNase。在本課題組前期研究中，重組乳酸菌誘導(dǎo)表達的SNase可在體外有效降解中性粒細胞刺激形成的NETs，并能通過灌胃乳酸菌成功被遞送至腸道發(fā)揮其降解NETs的作用[14]。

3.2 SNase緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎疾病指征

用TNBS建立小鼠結(jié)腸炎模型，提前3 d乳酸菌給藥，觀測小鼠生存情況，體質(zhì)量變化，DAI評分。在實驗第6天處死小鼠，分離結(jié)腸和脾臟，測量結(jié)腸長度和稱量脾臟重量。TNBS造模后小鼠生存3只，經(jīng)過LL處理小鼠生存4只，LL-SNase組小鼠生存3只。結(jié)果顯示，相比較于健康對照組，TNBS誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量下降(圖3-A)更明顯，DAI評分(圖3-B)顯著提高，結(jié)腸長度明顯縮短(圖3-C，圖3-D)，脾臟質(zhì)量也明顯增加(圖3-E)。經(jīng)LL-SNase給藥處理后，體質(zhì)量下降有所緩解，DAI評分也有下降，結(jié)腸長度明顯變長。從宏觀指標上看，SNase可以緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。

為進一步觀察SNase對結(jié)腸組織組織結(jié)構(gòu)和炎性細胞浸潤的影響，對結(jié)腸組織進行HE染色分析。由圖4-A可以看出，相比較于健康對照組，TNBS組結(jié)腸組織黏膜肌層結(jié)構(gòu)被破環(huán)，腺上皮細胞大量較少，結(jié)構(gòu)紊亂，而經(jīng)LL-SNase處理后，黏膜肌層結(jié)構(gòu)較為完整，腺上皮細胞增多，排布整齊。根據(jù)黏膜肌層結(jié)構(gòu)破環(huán)程度，杯狀細胞數(shù)量，隱窩結(jié)構(gòu)及中性粒細胞，淋巴細胞浸潤情況對各組結(jié)腸HE切片進行評分(圖4-B),LL-SNase組中TNBS小鼠的結(jié)腸組織損傷得到明顯改善。結(jié)果表明，SNase能夠很好地緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。

3.2 SNase緩解小鼠結(jié)腸組織炎性水平

為了探究乳酸菌遞呈的SNase對結(jié)腸組織炎性水平的影響，本研究測定了小鼠結(jié)腸組織MPO酶活。如圖5-A所示，相比較于健康對照組，TNBS組MPO酶活顯著提高，而LL-SNase處理明顯下調(diào) TNBS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO酶活性，提示SNase能夠改善TNBS小鼠結(jié)腸組織中性粒細胞浸潤狀況。本研究進一步對小鼠結(jié)腸組織炎性細胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6進行mRNA水平分析。如圖5B-5D顯示，相比較于健康對照組，TNBS組IL-1b mRNA水平明顯提高，TNF-ɑ和IL-6也有上升趨勢，但經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計無顯著性差異。經(jīng)LL-SNase處理后，IL-1b mRNA水平得到顯著抑制，TNF-ɑ和IL-6均有不同程度的下調(diào)。總的來說，SNase能從mRNA水平上改善TNBS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的炎性水平。

Figure2 12% SDS-PAGE analysis of SNase induced by nisin inL.lactispCYT:SNase

Lane 1:Protein marker；Lane 2:Supernant of the lysate ofL.lactispCYT:SNase；Lane 3:Supernant of the lysate ofL.lactispCYT:SNase induced by nisin (50 ng/mL)

A:Body weight changes;B:Disease activity index (DAI) scores;C:Images of colon;D:Relative colon lengths;E:Relative spleen weights LL:TNBS+NZ9000;LL-SNase:TNBS+L.lactispCYT:SNase

*P<0.05,**P<0.01vsTNBS group

A:Histological micro-photographs of hematoxylin/eosin-stained sections of distal colon (×200);B:Histological scores for histological change

*P<0.05,***P<0.001vsTNBS group

3.3 SNase改善結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎性因子水平

本研究對各組血清中與炎癥相關(guān)的細胞因子水平進行含量測定。如圖6所示，TNBS誘導(dǎo)的小鼠血清促炎細胞因子IL-6水平顯著提高,抑炎細胞因子IL-10顯著下降，TNF-ɑ、IL-1β、IL-17A和IFN-γ水平均有上升趨勢，但數(shù)據(jù)分析無顯著性差異。而LL-SNase處理能顯著上調(diào)TNBS結(jié)腸炎小鼠的抑炎細胞因子IL-10水平，不同程度下調(diào)促炎細胞因子水平。由此可以看出,SNase能改善小鼠體內(nèi)的炎癥水平。

A:Activity of myeloperaxidase (MPO) enzyme in colon;B:Relative mRNA expression level of TNF-ɑ;C:Relative mRNA expression level of IL-1β;D:Relative mRNA expression level of IL-6

*P<0.05,**P<0.01vsTNBS group

A:TNF-ɑ;B:IL-1β;C:IL-6;D:IL-17A;E:IFN-γ;F:IL-10

*P<0.05vsTNBS group

3.4 SNase能夠減少TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中NETs水平標志物含量

為了探究SNase靶向腸道是否可以抑制腸道NETs形成，本研究對各組結(jié)腸組織NETs水平標志物表達進行評估，通過免疫組化染色檢測結(jié)腸組織中NETs水平標志物citH3和中性粒細胞標記分子Ly6G表達。如圖7所示，TNBS組中Ly6G和citH3 含量明顯高于健康對照組，提示TNBS組小鼠體內(nèi)存在更顯著的NETs水平，而LL-SNase處理均能夠顯著下調(diào)TNBS小鼠結(jié)腸組織Ly6G和 citH3 含量。此外，MPO也是NETs水平的一個重要標志物，LL-SNase給藥處理也大大降低了其在TNBS小鼠結(jié)腸組織MPO酶的活性(圖5-A)。結(jié)果表明，SNase經(jīng)口給藥可以減少TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中NETs水平標志物含量，抑制腸道NETs形成。

A:Representative immunohistochemical images showing Ly6G-positive cell and citH3-positive cell in colon section (×200);B:Percentages of Ly6G-positive cell and citH3-positive cell in colon section

**P<0.01vsTNBS group

4 討 論

炎癥性腸病是一種病因不明的慢性腸道炎癥疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。這兩種疾病類型臨床診斷、發(fā)病部位及致病機制有所不同?？肆_恩病在整個胃腸道均可發(fā)病，多見于結(jié)腸部位，伴有腸道狹窄癥狀，主要是由Th1細胞引起的免疫反應(yīng)[17]。TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與臨床上克羅恩病的病癥表現(xiàn)相似，可用來研究克羅恩病的發(fā)病機制[18]。越來越多的證據(jù)表明NETs形成參與炎癥性腸病的致病形成，盡管部分研究表明NETs成分在潰瘍性結(jié)腸炎患者中檢測要比克羅恩病患者更為顯著。不可否認的是，確有多項研究表明NETs形成與克羅恩病相關(guān)。在克羅恩病患者糞便、血清和活檢組織中確實可檢測到NETs主要成分，包括citH3,NE,MPO等[19-22]。Cl-amidine是PAD4酶抑制劑，能抑制NETs的前期形成，Chumanevich等[23]發(fā)現(xiàn)腹腔注射Cl-amidine能夠緩解葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。由此看出，干預(yù)NETs降解是IBD治療的一個方向。

為探究SNase降解NETs對小鼠結(jié)腸炎的影響，同時為了讓SNase直接靶向到腸道而發(fā)揮作用，本研究選擇重組乳酸菌作為遞呈載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌遞呈的SNase能緩解TNBS造模小鼠體質(zhì)量下降，降低DAI評分，增加結(jié)腸長度以及減輕結(jié)腸組織病理損傷。MPO酶作為中性粒細胞特異性表達的酶，其活力水平可以反應(yīng)組織中性粒細胞浸潤情況。TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子上調(diào)是結(jié)腸炎炎癥的顯著表現(xiàn)。通過表達SNase的重組乳酸菌LL-SNase灌胃給藥，結(jié)果表明SNase能下調(diào)結(jié)腸組織MPO酶活水平以及TNF-ɑ、IL-1β、IL-6炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄水平。進一步利用免疫組化檢測結(jié)腸組織NETs水平標志物citH3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBS模型組citH3含量明顯上調(diào)，提示結(jié)腸炎中NETs形成活躍，經(jīng)LL-SNase處理后，中性粒細胞浸潤以及citH3含量明顯下調(diào)，而乳酸菌NZ9000也能改善NETs相關(guān)指標，可能因為乳酸菌本身作為益生菌，可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)從而抑制NETs形成。本研究結(jié)果初步表明，SNase能通過抑制NETs形成從而緩解小鼠結(jié)腸炎癥。

雖然本項研究存在一些不足，例如：TNBS造模病死率偏高，導(dǎo)致樣本較少，在統(tǒng)計學(xué)分析時部分指標只出現(xiàn)差異趨勢，未能得到理想的顯著性差異結(jié)果。但是，實驗結(jié)果依然可以初步顯示NETs參與克羅恩病小鼠的疾病發(fā)展，本研究通過SNase處理，靶向NETs降解可以緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，保護結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，緩解炎性浸潤下調(diào)促炎細胞因子和上調(diào)抑炎細胞因子等。后續(xù)本課題組將增加實驗動物數(shù)量，繼續(xù)深入探究SNase對TNBS造模小鼠結(jié)腸炎癥影響的機制?？偟膩碚f，SNase靶向NETs降解是克羅恩病的一個治療方向，其具體機制還需進一步探索。