高 琪，韓 月，許 薇，徐靜靜，王 旻，張 娟

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院抗體工程實(shí)驗(yàn)室，南京 211198)

腫瘤比正常組織代謝更快[1]，因此腫瘤的發(fā)生與發(fā)展需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)，為了滿足其需求，腫瘤在生長過程中會(huì)通過分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)血管新生[2-4]。臨床數(shù)據(jù)證明，實(shí)體瘤生長過程中都伴有血管新生，即便在血液瘤患者的骨髓中也發(fā)現(xiàn)大量的新生微血管，證明血管生成對(duì)實(shí)體瘤和血液瘤的發(fā)展都有重要的作用，因此抑制腫瘤血管新生成為抗腫瘤的一個(gè)策略[5]。目前已上市的針對(duì)血管生成的單克隆抗體藥物有靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的貝伐珠單抗及靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的雷莫盧單抗[6]，其中雷莫盧單抗能夠阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合，抑制VEGFR2的磷酸化，抑制下游信號(hào)通路，抑制腫瘤血管新生，從而發(fā)揮抗腫瘤效果[7]。但隨著腫瘤的快速生長，腫瘤內(nèi)部氧供應(yīng)不足引起缺氧，進(jìn)一步激活下游相關(guān)基因的表達(dá)，影響單抗藥物對(duì)腫瘤生長的抑制作用，最后導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[8]，如何提高缺氧環(huán)境下抗腫瘤血管生成抗體的藥效，成為亟待解決的重要問題。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose，2-DG)是一種人工合成的葡萄糖衍生物，50年代以來被廣泛用于科研和臨床研究[9]，其能夠被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，從而抑制細(xì)胞攝取葡萄糖。進(jìn)入細(xì)胞后2-DG被己糖激酶磷酸化生成6-磷酸-2-DG，而6-磷酸-2-DG不能被進(jìn)一步代謝，非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制己糖激酶，從而抑制糖酵解[10-11]。由于2-DG抑制了糖酵解的關(guān)鍵步驟，細(xì)胞糖酵解被抑制，導(dǎo)致ATP的產(chǎn)生減少，因此減緩細(xì)胞生長甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12-13]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，2-DG能夠抑制HIF-1α的表達(dá)，改善腫瘤缺氧微環(huán)境[14]。

JZC00是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的單鏈抗體，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)其能夠靶向VEGFR2，抑制VEGF與VEGFR2的結(jié)合，降低腫瘤血管密度，抑制腫瘤生長[15-16]。為了提高其活性，本研究選擇了2-DG與JZC00聯(lián)合使用，旨在探究JZC00與2-DG聯(lián)用在體外對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞LLC及4T1的抑制作用，并且建立體內(nèi)模型初步探究體內(nèi)抗腫瘤效果。

1 材 料

1.1 試 劑

羥氨芐青霉素、硫酸鏈霉素(上海生物工程股份有限公司)；2-脫氧葡萄糖(2-DG，上海源葉生物科技有限公司)；His標(biāo)簽抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (H+L) 、MTT粉末、蛋白Marker(上海翊圣生物科技有限公司)；乳酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；葡萄糖測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；JZCOO由本實(shí)驗(yàn)室篩選構(gòu)建，經(jīng)搖瓶發(fā)酵并純化得到。

1.2 細(xì)胞株

小鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系LLC、鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1購自中科院上海細(xì)胞所。

1.3 動(dòng) 物

四周齡雌性C57BL/6J小鼠(合格證號(hào)：201918997)和四周齡雌性BALB/c小鼠(合格證號(hào)：201927296)均購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物均自由進(jìn)食水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

LLC、4T1細(xì)胞均貼壁生長，采用含有10% FBS、0.1%氨芐青霉素、0.1%鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳1代。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔2×103個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，24 h后更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，高低劑量組改變2-DG濃度，JZC00濃度不變，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。每孔加入MTT 10 μL，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 和630 nm處吸收度，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。計(jì)算公式：抑制率=(對(duì)照組吸收度-實(shí)驗(yàn)組吸收度)/(對(duì)照組吸收度-空白組吸收度)×100%。

2.3 葡萄糖攝取及乳酸釋放速率測(cè)定實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞加入6孔板中，過夜后更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集上清液。葡萄糖濃度利用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)。乳酸濃度利用乳酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)。乳酸釋放抑制率計(jì)算公式：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組乳酸濃度/對(duì)照組乳酸濃度)]×100%；葡萄糖攝取抑制率計(jì)算公式：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組葡萄糖攝取率/對(duì)照組葡萄糖攝取率)]×100%。

2.4 蛋白免疫印跡

每個(gè)泳道中加入蛋白樣品50 ng，80 V恒壓30 min使樣品完全濃縮，轉(zhuǎn)換120 V恒壓電泳1.5 h。電泳結(jié)束后，200 mA轉(zhuǎn)膜100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含有5%脫脂牛奶的TBS溶液37 ℃封閉2 h，封閉后鼠抗His標(biāo)簽一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，之后孵育二抗。孵育結(jié)束后TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，凝膠成像系統(tǒng)成像并保存圖片。

2.5 動(dòng)物模型

LLC皮下移植瘤模型：小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將1×106個(gè)LLC細(xì)胞接種于C57BL/6J小鼠左側(cè)皮下，待平均瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只：PBS對(duì)照組、JZC00單獨(dú)用藥組(5 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00與2-DG 低劑量聯(lián)合用藥組(JZC00:5 mg/kg,2-DG:200 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00與2-DG高劑量聯(lián)合用藥組(JZC00:5 mg/kg,2-DG:800 mg/kg,iv,3次/周×2周)。給藥期間每兩天測(cè)量一次瘤體積，利用公式V= LW2/2(L,腫瘤最長直徑；W，垂直于L方向最長直徑)。兩周后處死小鼠，剝離瘤塊用于后續(xù)分析。

4T1原位乳腺癌模型：小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，麻醉小鼠將1×106個(gè)4T1細(xì)胞接種于BALB/c小鼠第4對(duì)乳腺脂肪墊內(nèi)，待平均瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，分組、給藥方式、給藥劑量、分析方法同LLC皮下移植瘤模型。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22、GraphPad Prism 8.0進(jìn)行分析，圖中數(shù)據(jù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，不同組別間差異用t檢驗(yàn)分析，P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

3 結(jié) 果

3.1 單鏈抗體的表達(dá)純化及鑒定

單鏈抗體JZC00由大腸埃希菌原核表達(dá)，利用鎳柱純化，將蛋白洗脫液制樣SDS-PAGE檢測(cè)，鑒定其純度及相對(duì)分子質(zhì)量。如圖1-A所示，JZC00經(jīng)鎳柱純化后相對(duì)分子質(zhì)量約為28 kD，符合理論值，并且條帶單一，達(dá)到電泳純度。對(duì)蛋白洗脫液進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖1-B所示，在28 kD左右檢測(cè)到條帶與SDS-PAGE結(jié)果保持一致，證明大腸埃希菌表達(dá)的單鏈抗體正確，可用于后續(xù)活性的研究。

Figure1 Purification and identification of single-chain antibody JZC00

A：SDS-PAGE of JZC00 after purification of nickel column；B：Western blot result of JZC00

3.2 JZC00及2-DG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

首先研究了JZC00與2-DG對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞系LLC、4T1增殖的影響。如圖2-A所示單鏈抗體JZC00對(duì)兩株細(xì)胞的增殖都有較顯著的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴性，JZC00濃度越高抑制作用越顯著。圖2-B顯示2-DG也可有效抑制兩株腫瘤細(xì)胞的增殖，隨著濃度的升高2-DG對(duì)腫瘤增殖的抑制作用增強(qiáng)。

3.3 JZC00及2-DG對(duì)腫瘤細(xì)胞糖酵解的影響

在不同濃度藥物作用48 h后，使用葡萄糖測(cè)定試劑盒及乳酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清液中葡萄糖和乳酸的濃度，探究JZC00和2-DG對(duì)腫瘤細(xì)胞糖酵解的影響。如圖3所示，在體外常氧條件下，JZC00能夠抑制腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取速率及乳酸釋放速率，證明JZC00能夠抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解。當(dāng)JZC00與2-DG聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤細(xì)胞乳酸釋放速率及葡萄糖攝取速率與2-DG單藥組相比顯著下降，證明JZC00與2-DG能夠協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解。在體內(nèi)，腫瘤內(nèi)部微環(huán)境中的氧含量顯著低于正常組織，低氧環(huán)境下腫瘤組織中HIF-1α的含量升高，升高的HIF-1α激活下游相關(guān)基因的表達(dá)?？寡苌伤幬镌谀[瘤缺氧條件下藥效下降甚至產(chǎn)生耐藥[2，17]，而2-DG可以在體內(nèi)下調(diào)HIF-1α的含量[18]，因此猜測(cè)2-DG 在缺氧條件下可以恢復(fù)抗血管生成藥物對(duì)于腫瘤生長的抑制作用。本研究選擇了二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG)，它是HIF-1α脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠抑制HIF-1α的降解，因此通過DMOG可以在體外模擬HIF-1α高表達(dá)的缺氧環(huán)境。如圖4所示在加入DMOG后，JZC00對(duì)于腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸釋放抑制能力顯著下降。當(dāng)加入2-DG后JZC00對(duì)腫瘤細(xì)胞糖酵解抑制能力恢復(fù)至常氧時(shí)的水平，說明HIF-1α?xí)p弱JZC00對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制，但2-DG能夠逆轉(zhuǎn)HIF-1α對(duì)JZC00的抑制。

A:MTT assays of JZC00 on the inhibition of LLC and 4T1 cells;B:MTT assays of 2-DG on the inhibition of LLC and 4T1 cells

Figure3 JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells

Figure4JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells under hypoxia

3.4 單鏈抗體及2-DG的體內(nèi)活性研究

前期的實(shí)驗(yàn)證明，JZC00及2-DG在體外能夠抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解從而抑制其增殖，為了探究二者聯(lián)合用藥在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤的抑制作用，構(gòu)建了小鼠非小細(xì)胞肺癌皮下移植瘤模型及小鼠乳腺癌原位模型。給藥2周后，處死小鼠剝離腫瘤組織進(jìn)行分析。如圖5-A、5-B所示，JZC00單獨(dú)用藥組、JZC00聯(lián)合2-DG(200 mg/kg)組、JZC00聯(lián)合2-DG(800 mg/kg)組均具有抗腫瘤活性，另外發(fā)現(xiàn)聯(lián)合2-DG后JZC00的抑瘤效果顯著提升。對(duì)剝離的腫瘤進(jìn)行稱重并計(jì)算抑瘤率。從圖5-C、5-D發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組與對(duì)照組相比瘤重顯著降低，且高劑量組藥效提高最顯著，抑瘤率達(dá)到75%。圖5-E是各組小鼠給藥期間體質(zhì)量曲線，根據(jù)圖中所示給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化無顯著性差異，證明單鏈抗體JZC00及2-DG在產(chǎn)生抗腫瘤作用的同時(shí)對(duì)小鼠沒有顯著毒性。

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 15-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 15-day treatment;D:Inhibition rate of different groups;E:The body weight curve of different group*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.NS:no significance

2-DG聯(lián)合JZC00在體外顯著抑制腫瘤細(xì)胞LLC、4T1的糖酵解及增殖能力，同時(shí)在LLC皮下移植瘤模型中具有較好的抑瘤效果，因此建立了小鼠乳腺癌原位模型。如圖6-A、6-B所示聯(lián)合用藥高劑量組相較于JZC00組、聯(lián)合用藥低劑量組有更優(yōu)的抗腫瘤效果。圖6-C、6-D所示聯(lián)合用藥組、JZC00組均顯著降低了瘤重，且高劑量組藥效提高最顯著，抑瘤率達(dá)到了58%。并且根據(jù)圖6-E所示，各組小鼠給藥期間體質(zhì)量無顯著變化，顯示聯(lián)合用藥對(duì)小鼠無顯著毒性。

4 討 論

肺癌和乳腺癌分別是中國男性和女性發(fā)病率最高的癌癥，研究表明這兩種腫瘤在生長過程中均會(huì)誘導(dǎo)血管新生，以滿足其對(duì)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的需求,進(jìn)而維持腫瘤生長。

本課題組在前期工作中得到了靶向VEGFR2的單鏈抗體JZC00，通過驗(yàn)證其能與VEGFR2結(jié)合，抑制腫瘤血管新生，具有較強(qiáng)的抑瘤作用。 2-DG是一種人工合成的糖酵解抑制劑，它在抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解和腫瘤細(xì)胞生長的同時(shí)，還能在體內(nèi)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)[15，19]。腫瘤細(xì)胞的主要產(chǎn)能方式是糖酵解但其還會(huì)通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生能量，因此在臨床試驗(yàn)中2-DG單獨(dú)使用療效不顯著。但本研究認(rèn)為抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，同時(shí)能夠下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)從而改善腫瘤微環(huán)境，提高抗體藥物對(duì)腫瘤的抑制作用?；诖诉x擇將JZC00與2-DG聯(lián)合使用提高抗腫瘤活性。

Figure6 JZC00 and 2-DG demonstrateinvivoefficacy against 4T1 orthotopic model

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 19-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 19-day treatment;D:Inhibition rate of different group;E:Body weight curve of different group

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.NS:no significance (n=5)

本實(shí)驗(yàn)通過大腸埃希菌發(fā)酵得到了單鏈抗體JZC00，利用MTT法分別檢測(cè)了JZC00、2-DG對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞系LLC、4T1的增殖抑制活性。隨后在體外常氧及體外模擬缺氧條件下測(cè)定乳酸釋放速率、葡萄糖攝取速率，發(fā)現(xiàn)JZC00在HIF-1α高表達(dá)情況下抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解能力下降，而2-DG可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。選用C57BL/6J小鼠建立LLC皮下移植瘤模型、BALB/c小鼠建立4T1原位乳腺癌模型，以JZC00為對(duì)照初步驗(yàn)證了聯(lián)合用藥組的療效，當(dāng)2-DG達(dá)到臨床給藥劑量時(shí)，聯(lián)合用藥組抑瘤效果顯著增強(qiáng)。JZC00與2-DG的聯(lián)合使用通過抑制腫瘤血管新生及腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑提高了JZC00的抑瘤效果。本文研究了JZC00與2-DG在常氧及誘導(dǎo)缺氧條件下對(duì)于腫瘤細(xì)胞糖酵解的抑制作用，但對(duì)于真正缺氧條件下的抑制作用未作研究，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了研究，但對(duì)于抗腫瘤血管生成抗體耐藥細(xì)胞株還需下一步研究。