楊莉莉，張金水，李 娜，同延安

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

乙酰丙酸(Levulinic acid，LA)，又名左旋糖酸、戊隔酮酸，它的分子中有一個羰基和一個羧基，有良好的反應(yīng)性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等領(lǐng)域，被認為是一種非常有潛力的綠色平臺化合物[1-3]。它主要是通過生物質(zhì)的水解來制得，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，原料來源廣泛[4]。5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic Acid，5-ALA)是廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)的天然氨基酸，是生物化學(xué)中至關(guān)重要的化合物，它是四氫吡咯(構(gòu)成血紅素、細胞色素、維生素B12的物質(zhì))的前綴化合物，也是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等必不可少的物質(zhì)，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-6]。在農(nóng)業(yè)上，5-ALA主要被用作除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。目前，國內(nèi)外分別研究建立了化學(xué)合成和微生物發(fā)酵制生產(chǎn)ALA的工藝路線[7-10]，兩種工藝均有LA的參與，在化學(xué)合成方法中，LA是初始原料；在微生物發(fā)酵法中，LA起到ALA脫氫酶抑制劑的作用，促進ALA的積累。國內(nèi)外已有不少研究認為ALA可以提高植物葉綠素含量、促進光合作用[11-14]、增加作物產(chǎn)量[6，15-16]、提高作物的抗逆性[17-20]等，但是由于ALA產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)主要通過高成本、高污染和得率低的化學(xué)法合成，導(dǎo)致ALA價格較高[5，21-22]，2015年價格為每克2 500元左右，這限制了其廣泛使用，目前用ALA進行試驗的較多，還未見大面積推廣應(yīng)用；而與ALA關(guān)系密切的LA作為一種非常有潛力的綠色平臺化合物，生產(chǎn)工藝簡單，價格較低，2013年的價格僅為每千克5～8美元。LA是否可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑對作物產(chǎn)生類似ALA的作用僅見于葡萄[23]和蔬菜[24]上的研究，為了探究LA的作用，本研究以蘋果為研究對象，通過葉面噴施不同濃度的LA，探究LA對蘋果生長和產(chǎn)量的影響，以期為LA在植物上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的蘋果為‘紅富士’，供試噴施藥品有效成分是乙酰丙酸，質(zhì)量濃度為5.3 g/L。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)10個處理，分為3個不同的噴施時期(5、6月，5、6、7月，5、6、7、8月)和3個不同的噴施稀釋倍數(shù)(稀釋600倍、800倍、1 000倍)及對照處理，每個處理選擇長勢均勻且無病害的5棵‘紅富士’果樹，重復(fù)3次，田間隨機區(qū)組排列。即在5、6月中旬分別選擇45棵樹噴施稀釋600倍、800倍、1 000倍的乙酰丙酸，對其中的15棵做標記，7、8月份不再噴施乙酰丙酸，僅噴施等量清水；7月中旬每個噴施稀釋倍數(shù)下的其余30棵樹繼續(xù)噴施相應(yīng)稀釋倍數(shù)的乙酰丙酸，其中15棵做標記，8月份僅噴等量清水；8月中旬給每個稀釋倍數(shù)處理的最后15棵樹噴施相應(yīng)質(zhì)量濃度的乙酰丙酸，對照處理分別在5、6、7、8月中旬噴施等量清水(表1)。為了探究不同環(huán)境及不同樹齡是否影響乙酰丙酸的效果，試驗在陜西蒲城和鳳翔兩地同時進行，蒲城地區(qū)為7 a生‘紅富士’，鳳翔地區(qū)為9 a生‘紅富士’。果園施肥、灌溉、修剪等其他措施均與當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣一致。

表1 蘋果乙酰丙酸噴施方案Table 1 Spray concentration and time of levulinic acid in apple orchards

1.3 樣品采集與測定

9月中旬測定葉綠素SPAD值和百葉鮮質(zhì)量。采樣方法為：沿果樹四周采集當(dāng)年新生枝條中上部葉片，每株20～30片，采后立即用便攜式SPAD-502葉綠素儀測定葉綠素SPAD值；將每個處理按重復(fù)混勻后隨機選取100片，用電子天平測定百葉鮮質(zhì)量。果實收獲時，從果樹的東南西北4個方向采集果實，每個小區(qū)采集30個，帶回實驗室用于品質(zhì)測定；每個小區(qū)實際收獲的果實為每個小區(qū)的總產(chǎn)量?？扇苄蕴琴|(zhì)量分數(shù)用蒽酮比色法測定，可滴定酸用NaOH滴定法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0 和Excel 2007處理數(shù)據(jù)和 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋倍數(shù)和噴施時間對蘋果葉片葉綠素SPAD值的影響

噴施不同稀釋倍數(shù)(不同時期平均值)和同一稀釋倍數(shù)不同噴施時間的蘋果葉片在成熟期的葉綠素SPAD值如表2。兩地均是噴施乙酰丙酸處理的葉片葉綠素SPAD值顯著高于對照處理，但隨著稀釋倍數(shù)的增加，葉綠素SPAD值又呈現(xiàn)降低的趨勢，噴施稀釋600倍處理的葉綠素SPAD值最高，鳳翔和蒲城兩地分別為62.40和57.77，顯著高于稀釋1 000倍的處理。同一稀釋倍數(shù)不同噴施時間的葉綠素SPAD值均表現(xiàn)為5、6、7月和5、6、7、8月噴施處理顯著高于5、6月噴施處理，5、6、7與5、6、7、8月噴施間無顯著性差異。表明噴施乙酰丙酸可以增加蘋果葉片葉綠素SPAD值，且增加的幅度與稀釋倍數(shù)和噴施時間有關(guān)。

2.2 不同稀釋倍數(shù)和噴施時間對蘋果百葉鮮質(zhì)量的影響

從表3可以看出，噴施不同稀釋倍數(shù)對蘋果百葉鮮質(zhì)量的影響與對葉綠素SPAD值的影響呈現(xiàn)相同特點，噴施乙酰丙酸處理的百葉鮮質(zhì)量均顯著高于對照處理。不同稀釋倍數(shù)處理的百葉鮮質(zhì)量表現(xiàn)為：稀釋600倍>稀釋800倍>稀釋1 000倍>對照。不同噴施時間對百葉鮮質(zhì)量的影響以5、6月份噴施的效果明顯比5、6、7月和5、6、7、8月份噴施的效果好。表明百葉鮮質(zhì)量同葉綠素類似，也會因噴施乙酰丙酸而增加，且與噴施時期和稀釋倍數(shù)有關(guān)。

表2 乙酰丙酸不同稀釋倍數(shù)和噴施時間下葉片葉綠素SPAD值Table 2 Chlorophyll SPAD value in apple leaves of spraying concentration and time of levulinic acid

注：同列同一稀釋倍數(shù)中不同字母表示差異達顯著水平(P<0.05)；其余同列不同字母表示不同稀釋倍數(shù)處理差異顯著(P<0.05)。 下同。

Note:Different letters in the same dilution multiple of the same column indicate significant difference atP<0.05 level,and other different letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 levels under different treatments.The same below.

表3 乙酰丙酸不同稀釋倍數(shù)和噴施時間下蘋果百葉鮮質(zhì)量Table 3 Fresh mass of onehundred leaves of spraying concentration and time of levulinic acid

2.3 不同稀釋倍數(shù)和噴施時間對蘋果產(chǎn)量的 影響

由表4可見，與對照相比，兩地噴施不同稀釋倍數(shù)乙酰丙酸均增加了蘋果產(chǎn)量，且稀釋600倍處理的產(chǎn)量最高，分別高于對照16.48%和 12.41%(P<0.05)；稀釋600倍與800、1 000倍之間的差異不顯著。鳳翔地區(qū)，不同噴施時期對蘋果產(chǎn)量無顯著性影響；蒲城地區(qū)，在稀釋600倍和800倍條件下，5、6、7月和5、6、7、8月噴施的產(chǎn)量顯著高于5、6月的。

兩地試驗結(jié)果表明，與噴施時間相比，噴施不同稀釋倍數(shù)對蘋果產(chǎn)量的影響較大，且不同樹齡不同生長環(huán)境的果樹對不同噴施時期的產(chǎn)量效應(yīng)有差異。

表4 乙酰丙酸不同稀釋倍數(shù)和噴施時間下蘋果產(chǎn)量Table 4 Apple yield of spraying concentration and time of levulinic acid

2.4 不同稀釋倍數(shù)和噴施時間對蘋果品質(zhì)的 影響

從表5可以看出，兩地不同時期噴施相同稀釋倍數(shù)的乙酰丙酸對果實可溶性糖質(zhì)量分數(shù)均無顯著性影響，且蒲城地區(qū)的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)整體高于鳳翔地區(qū)。鳳翔地區(qū)噴施乙酰丙酸處理的果實可溶性糖質(zhì)量分數(shù)均顯著高于對照處理，但不同稀釋倍數(shù)之間差異不顯著；蒲城地區(qū)噴施稀釋600倍、1 000倍乙酰丙酸的處理果實可溶性糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于對照。表明任何時期噴施任何稀釋倍數(shù)的乙酰丙酸均可以增加蘋果果實可溶性糖質(zhì)量分數(shù)。

鳳翔地區(qū)蘋果果實可滴定酸質(zhì)量分數(shù)不受乙酰丙酸噴施時期和噴施不同稀釋倍數(shù)的影響；蒲城地區(qū)稀釋800和1 000倍的濃度下，5、6月噴施處理的果實可滴定酸質(zhì)量分數(shù)顯著低于5、6、7月和5、6、7、8月份噴施處理的(表5)。影響果實風(fēng)味及口感的主要是糖酸比，兩地區(qū)不同處理間糖酸比差異均不顯著，但噴施乙酰丙酸的處理略高于對照，其中以稀釋600倍的糖酸比較對照增加最多。表明噴施乙酰丙酸可以一定程度改善蘋果果實品質(zhì)。

3 討 論

大量研究表明5-ALA可以提高作物葉綠素含量，增強植物的光合能力[25-28]，這與ALA是葉綠素合成的前提物質(zhì)[6，29]有關(guān)。而LA是5-ALA的脫氫酶抑制劑[22，30]，在植物體內(nèi)，LA會抑制 5-ALA合成葉綠素，促使植物體內(nèi)5-ALA積累[31-32]；在微生物培養(yǎng)中，增加LA，會使5-ALA合成酶活性增加、脫氫酶活性降低，達到增加 5-ALA產(chǎn)量的效果[33]。楊莉莉等[23]和王小英等[24]分別在葡萄和葉菜上的研究發(fā)現(xiàn)噴施LA能增加植物葉片的葉綠素SPAD值，且葡萄和生菜葉片葉綠素SPAD值均在稀釋600倍時最高。本研究中發(fā)現(xiàn)噴施LA顯著提高蘋果葉片葉綠素SPAD值和百葉鮮質(zhì)量，且受噴施稀釋倍數(shù)和噴施時期的影響，原因可能是噴施LA后，使植物體內(nèi)的5-ALA脫氫酶活性受抑制，使5-ALA在植物體內(nèi)短暫積累，且可能使5-ALA活性增加，隨后積累的5-ALA再促使葉綠素合成的增加[23]或通過改變四吡咯代謝和轉(zhuǎn)錄[34]，從而使光合效應(yīng)增強，促進葉片中物質(zhì)的積累，增加葉片鮮質(zhì)量。這與5-AlA的作用類似[35-36]，可以增加葉綠素、葉片鮮質(zhì)量，促進植物生長。

關(guān)于5-ALA對作物產(chǎn)量的影響，已經(jīng)有大量研究報道[6，15，37]。5-ALA增加作物產(chǎn)量的原因被認為與ALA增加葉綠素，提高葉片光合能力，從而促進干物質(zhì)積累有關(guān)[25，27，34，38]。本研究中，LA處理均能提高兩地的蘋果產(chǎn)量，且以稀釋600倍處理的增產(chǎn)效果最好。這與楊莉莉等[23]和王小英等[24]分別在葡萄和葉菜上的研究結(jié)果一致，原因可能與LA是5-ALA的脫氫酶抑制劑，通過影響5-ALA來影響產(chǎn)量。5-ALA對產(chǎn)量的影響報道較多的是對作物可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的影響[28，39]，本研究通過對果實可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的分析表明，與對照相比，不同施用時期對其影響不顯著，不同噴施稀釋倍數(shù)的影響較顯著。這可能是由于光合速率的增加導(dǎo)致碳水化合物的增加[28]或者促進可溶性糖合成途徑中重要酶的合成或提高酶的活性[38]而促使可溶性糖質(zhì)量分數(shù)增加。

5-ALA對作物的作用效果與其施用的稀釋倍數(shù)、時間及作物種類等有關(guān)[6，40]，本研究中同一稀釋倍數(shù)水平下，均以5、6、7月份噴施和5、6、7、8月份噴施對蘋果生長和產(chǎn)量的影響效果優(yōu)于5、6月噴施的效果，可能與LA效果維持的時間有關(guān)。LA對兩地蘋果生長和產(chǎn)量品質(zhì)的影響差異除了與稀釋倍數(shù)和噴施時期有關(guān)外，還可能與兩地樹齡和生長環(huán)境不同有關(guān)，但總體均是以5、6、7月份噴施稀釋600倍LA的處理作用效果最佳，這可能是LA對ALA影響的原因，但具體的作用機制還需進一步研究。

4 結(jié) 論

噴施適宜濃度的乙酰丙酸能提高蘋果葉片葉綠素SPAD值、增加葉片鮮質(zhì)量、增加蘋果產(chǎn)量和改善品質(zhì)，且以5、6、7月和5、6、7、8月份噴施稀釋600倍乙酰丙酸的處理作用效果最佳，考慮到人工成本和時間成本，建議生產(chǎn)上在5、6、7月份噴施稀釋600倍的乙酰丙酸來改善蘋果生長狀況和提高產(chǎn)量品質(zhì)。