張 超，付三雄，唐 容，周小嬰，黃 莎，王璐璐，楊克相，戚存扣

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 貴州省油料研究所，貴陽 550006；2.江蘇省農(nóng)科院 經(jīng)濟作物研究所，南京 210014)

3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)的主要作用是將糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate, DHAP)加氫還原成甘油3磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)，是植物體內(nèi)G3P合成的限速酶之一[1-2]。在酵母和衣藻等微生物中的研究表明，GPDH在維持細胞內(nèi)的甘油平衡及促進油脂，即三脂酰甘油(triacylglycerol, TAG)的合成方面具有重要作用[3-5]；在高等植物甘藍型油菜(Brassicanapus L.)中過量表達酵母胞質(zhì)型GPD1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜種子中TAG的合成量增加了40%，且糖酵解的中間產(chǎn)物DHAP迅速減少[6]，將種子特異表達的AtDGAT1和酵母胞質(zhì)型GPD1共表達載體轉(zhuǎn)到亞麻芥中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系種子含油量比野生型提高13%[7]。此外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)GPDH在調(diào)節(jié)滲透壓[8]、防御病原菌侵害[9]及增強對鹽分等逆境脅迫的適應(yīng)[10]方面也具有重要的作用。

在模式植物擬南芥中有5個GPDH基因，根據(jù)亞細胞定位分為3類，其中有2個基因為質(zhì)體型(plastidic glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHp)，2個基因為細胞質(zhì)型(cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHc)，另外1個則為線粒體型(mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHm)[11-14]。AtGPDHm主要在線粒體膜上將G3P氧化成DHAP，與AtGPDHc協(xié)同作用形成G3P穿梭機制，維持細胞內(nèi)的G3P動態(tài)平衡[12-13]，AtGPDHm在種子萌發(fā)時表達較高，并受ABA及逆境脅迫的影響[12]，在鹽生杜氏藻中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能夠促進GPDHm的表達，而缺氧和低溫能夠抑制其表達[15]，推測GPDHm可以通過調(diào)控G3P氧化成DHAP這一釋放能量的代謝過程來應(yīng)對不同的脅迫條件。AtGPDHp的N端序列具有典型的葉綠體信號肽，且AtGPDHp與AtGPDHc的氨基酸序列差異較大[11]，在水稻中過量表達質(zhì)體型基因AtGLY1顯著提高了水稻質(zhì)體脂類的含量，而對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑合成的脂類含量沒有明顯影響[16]，可見GPDHp與GPDHc可能存在功能分化；另外，由于TAG的合成是在細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進行的，相關(guān)研究已經(jīng)證實過量表達GPDHc能夠顯著促進TAG合成[6-7]，表明GPDHc在參與種子存儲物質(zhì)TAG的合成中的作用更關(guān)鍵。

目前蓖麻[17]、水稻[18]、玉米[10, 19]的GPDH已有研究報道，在甘藍型油菜中也有部分GPDH被克隆和鑒定[20-21]，但針對BnGPDH家族的全基因組鑒定和分析尚未見報道，尤其是BnGPDHc與油菜種子TAG合成的關(guān)系尚不明確，因此，本研究利用已公布的甘藍型油菜參考基因組對BnGPDH進行了全基因組鑒定，全面分析BnGPDH基因結(jié)構(gòu)、氨基酸保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化樹、染色體分布，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)的方法分析BnGPDHc在甘藍型油菜不同組織器官中的表達模式，并比較BnGPDHc在高、低含油量自交系材料中的表達差異，為研究BnGPDH在油菜種子TAG積累中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的甘藍型油菜高含油量自交系‘IL130’‘IL474’‘IL594’及低含油量自交系‘IL134’‘IL202’‘IL525’由貴州省農(nóng)業(yè)科學院貴州省油料研究所提供，2017-2018年度種植于貴陽試驗地，于盛花期標記開放花朵，并取盛花期的根(Root)、莖(Shoot)、葉(Leaf)、花(Flower)、蕾(Bud)以及7、14、21、30、40DAF(day after flower)角果皮(Pericarp)和種子(Seed)，液氮速凍后，于-80 ℃保存，用于基因組織表達模式分析和差異表達分析。

1.2 甘藍型油菜、白菜和甘藍中GPDH基因的鑒定

在擬南芥TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站下載AtGPDH蛋白序列，利用BlastP[22]比對Brassicadatabase (BRAD, http://brassicadb.org/brad/index.php)[23]中公布的甘藍型油菜、白菜(BrassicarapaL.)、甘藍(BrassicaoleraceaL.)基因組測序數(shù)據(jù)，獲得BnGPDH、BrGPDH及BoGPDH蛋白序列，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析程序核對確認；基于在線網(wǎng)站ExPASY(https://web.expasy.org/compute_pi/)[24]預測蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量、相對分子量和等電點。

1.3 BnGPDH的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分析及染色體定位

運用MEGA 7.0軟件[25]的ClustalW進行序列比對并采用鄰接法(neighbour-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)設(shè)置bootstrap重復1 000次；在BRAD數(shù)據(jù)庫中獲得BnGPDH、BrGPDH及BoGPDH的基因組DNA序列、編碼區(qū)(coding sequenc，CDS)序列、內(nèi)含子、外顯子等物理位置信息，用Gene Structure Display Server (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[26]分析BnGPDH基因結(jié)構(gòu)；利用MEME(http://meme-suite.org/)[27]進行BnGPDH蛋白序列的保守元件分析，最大基序檢索值設(shè)置為10，其他設(shè)置采用默認；使用Mapchart 2.2軟件[28]對BnGPDH的染色體位置進行展示。

1.4 RNA提取與qRT-PCR分析

采用生工生物工程(上海)股份有限公司EZ-10 DNA away RNA提取試劑盒提取樣品RNA，濃度測定和質(zhì)量檢測后用大連寶生物工程有限公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成第一鏈cDNA，并按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明在CFX96熒光定量檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)上進行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件為：95 ℃預變性 90 s，接著95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸35 s，然后采集熒光信號，共40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后從 60 ℃升溫到95 ℃進行融解曲線分析；運用CT法計算相對表達量[29]；內(nèi)參基因采用BnUBC21(EV086936)；每個反應(yīng)3個生物學重復，3次技術(shù)重復；qRT-PCR所用引物見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used in qRT-PCR

2 結(jié)果和分析

2.1 GPDH基因的全基因組鑒定和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

GPDH基因在甘藍型油菜、甘藍和白菜中分別鑒定出18、10和9個成員。18個BnGPDH基因中，gDNA長度從2 058 bp(BnGPDHp1-3)到 3 893 bp(BnGPDHm-4)不等，對應(yīng)的CDS序列長度也是從1 071 bp變化到1 896 bp；相對分子質(zhì)量最低的是BnGPDHp1-1的38.88 ku，最高的為BnGPDHm-2的67.93 ku；等電點從6.08(BnGPDHp1-1)到9.03(BnGPDHm-1)(表2)。

對甘藍型油菜、白菜、甘藍和擬南芥4個物種的GPDH蛋白進行序列分析后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，GPDH蛋白被分為3個亞家族(圖1)：GPDHp亞家族、GPDHc亞家族和GPDHm亞家族。3個亞家族中均包含6個BnGPDH和3個BrGPDH，其中GPDHp亞家族和GPDHc亞家族均有2個AtGPDH和3個BoGPDH，而GPDHm亞家族有1個AtGPDH和4個BoGPDH。

表2 甘藍型油菜、白菜、甘藍GPDH基因Table 2 GPDH genes in Brassica napus L., Brassica rapa L., Brassica oleracea L.

圖1 甘藍型油菜、白菜、甘藍及擬南芥GPDH系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Analysis of phylogenetic tree of B.napus, B.rape, B.oleracea, and Arabidopsis GPDH proteins

2.2 BnGPDH的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

染色體位置分布顯示，18個BnGPDH分布在A、C基因組的10條染色體上，其中，A01、A03和C01、C03染色體上只分布有1個BnGPDH基因，A04、A07、C05、C06染色體上均分布有2個BnGPDH基因，而A05和C04上各分布3個BnGPDH基因(圖2)。

基因的結(jié)構(gòu)分析表明，BnGPDHp亞家族中的外顯子數(shù)目明顯多于BnGPDHm和BnGPDHc兩個亞家族，BnGPDHp亞家族中BnGPDHp2-1和BnGPDHp2-2具有8個外顯子，另外4個成員外顯子數(shù)目都為10個，而BnGPDHc亞家族中除了BnGPDHc1-2有6個外顯子，其余5個成員都有5個外顯子，BnGPDHm家族中BnGPDHm-1和BnGPDHm-2具有5個外顯子，另外4個成員有6個外顯子(圖3-A)，同一個亞家族內(nèi)的基因成員外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相對 一致。

保守結(jié)構(gòu)域分析總共在BnGPDH蛋白中預測出20個保守元件，其中，只有元件2和元件7在所有BnGPDH中都存在，元件6、10、13、15、17只存在于BnGPDHm亞家族成員中；除了BnGPDHc2中的兩個成員不包含元件20外，BnGPDHc亞家族中的6個成員都具有元件2、3、4、5、7、8、9、11、12、14、16和20；BnGPDHp亞家族成員具有較少的元件，其中BnGPDHp1中的4個成員基因都具有相同的元件，即元件1、2、4、7、11、12、14、18、19和20，BnGPDHp2中的兩個成員只有元件2、7、18與BnGPDHp1成員相同；而BnGPDHm亞家族中的6個成員都包含16個同樣的元件(圖3-B)，可見亞家族內(nèi)的成員具有比較一致的元件，而亞家族間的保守元件差異較大。

2.3 BnGPDHc的表達模式分析

為了明確BnGPDHc組織表達特征，采用qRT-PCR檢測了BnGPDHc在高含油量自交系IL130盛花期的根、莖、葉、花、蕾，以及7、14、21、30、40DAF的角果皮和種子中的表達情況，結(jié)果顯示，BnGPDHc亞家族中的不同成員在不同組織器官中的表達量各不相同；BnGPDHc1-1、BnGPDHc1-2和BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2在各個組織器官中均有表達，且這4個基因在不同發(fā)育時期種子中的表達趨勢一致：在7DAF中相對表達量較高，在14DAF略有下降，到21DAF、30DAF達到表達高峰，而40DAF則開始下降；此外，這4個基因在角果發(fā)育前期(7DAF、14DAF、21DAF)角果皮中的相對表達量要略高于后期(30DAF、40DAF)。BnGPDHc1-3和BnGPDHc1-4具有明顯的組織表達特異性，BnGPDHc1-3在蕾、花中相對表達量較高，其次是21DAF、30DAF和40DAF的種子中，而BnGPDHc1-4在30DAF、40DAF的種子和根中的相對表達量較高，在其余的組織部位中幾乎不表達(圖4)?？傮w而言，BnGPDHc的6個成員在21DAF、30DAF、40DAF的種子中的表達更為活躍。

圖2 BnGPDH在甘藍型油菜染色體上的位置Fig.2 Chromosomes location of BnGPDH genes

圖3 BnGPDH基因結(jié)構(gòu)(A)和BnGPDH蛋白保守元件(B)Fig.3 Gene structures of BnGPDH genes (A) and conserved motifs of BnGPDH(B)

Ro.根；St.莖；Le.葉；Bu.蕾；F.花；7dS.7DAF種子；14dS.14DAF種子；21dS.21DAF種子；30dS.30DAF種子；40dS.40DAF種子；7dP.7DAF角果皮；14dP.14DAF角果皮；21dP.21DAF角果皮；30dP.30DAF角果皮；40dP.40DAF角果皮(下同)

Ro.Root；St.Stem；Le.Leaf；Bu.Bud；F.Flower；7dS.Seed of 7DAF；14dS.Seed of 14DAF；21dS.Seed of 21DAF；30dS.Seed of 30DAF；40dS.Seed of 40DAF；7dP.Silique pericarp of 7DAF；14dP.Silique pericarp of 14DAF；21dP.Silique pericarp of 21DAF；30dP.Silique pericarp of 30DAF；40dP.Silique pericarp of 40DAF(the same below)

圖4BnGPDHc在自交系IL130中的組織表達模式分析
Fig.4 Tissue-specific expression patterns ofBnGPDHcgenes in inbred line IL130

2.4 BnGPDHc在高、低含油量自交系中的差異表達分析

對BnGPDHc在3對高、低含油量自交系的不同組織器官中的相對表達量進行分析發(fā)現(xiàn)：在葉片和21DAF、30DAF、40DAF的角果皮中BnGPDHc的相對表達量較低，而在花和蕾中的相對表達量較高，但這些組織部位中BnGPDHc的相對表達量在高、低含油量材料間差異不顯著；在21DAF的種子中BnGPDHc1-2和BnGPDHc2-1的相對表達量在高、低含油量材料間存在顯著差異，30DAF的種子中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在高含油量材料中的相對表達量要顯著高于低含油量材料，40DAF種子中BnGPDHc的相對表達水平在高、低含油量材料間差異不顯著(圖5)。這些結(jié)果說明，BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2可能與種子TAG的積累相關(guān)。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)

* Indicates significant difference atP<0.05;** Indicates significant difference atP<0.01

圖5BnGPDHc在高、低含油量自交系不同組織器官中的差異表達
Fig.5 Differential expressions ofBnGPDHcgenes between high and low seed oil content inbred lines in different tissues

3 討 論

GPDH在促進TAG的合成[5-7]、滲透壓的調(diào)節(jié)[8,10]、防御病原菌侵害[9]等方面具有重要作用，在蓖麻[17]、水稻[18]、玉米[10,19]及甘藍型油菜[20-21]中已有部分GPDH被克隆和鑒定，但針對BnGPDH家族的全基因組鑒定尚未見報道。甘藍型油菜(AACC，2n=4x=38)是白菜(AA, 2n=2x=20)和甘藍(CC, 2n=2x=18)2個二倍體祖先種通過天然遠緣雜交形成的異源四倍體作物，理論上擬南芥的單個基因在白菜和甘藍基因組上應(yīng)該有3個拷貝，在甘藍型油菜基因組上應(yīng)該有6個拷貝[30]，本研究在甘藍型油菜、甘藍、白菜和擬南芥中分別鑒定出18、10、9及5個GPDH基因，白菜和甘藍進化成甘藍型油菜的過程中僅有1個GPDH基因丟失，而擬南芥在進化成白菜和甘藍的過程中卻出現(xiàn)了更多的GPDH基因丟失，這一現(xiàn)象與高堃等[31]發(fā)現(xiàn)的甘藍型油菜中PIN1s基因數(shù)量遠少于甘藍和白菜中PIN1s基因總數(shù)的現(xiàn)象有所不同，可見不同的基因在進化和遺傳上具有一定的差異性。

起源于同一拷貝的基因擁有類似的基因結(jié)構(gòu)和保守元件[32]，例如對BnCKX家族的分析[33]，本研究基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)同一個亞家族內(nèi)起源于同一個擬南芥基因的BnGPDH外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相對一致；保守元件分析發(fā)現(xiàn)BnGPDHm的6個成員具有完全相同的保守元件，BnGPDHc的6個成員保守元件也高度相似，暗示BnGPDHm和BnGPDHc這2個亞家族內(nèi)的基因功能分化較小，但是否存在功能冗余則需要進一步的試驗證明；BnGPDHm亞家族又分為BnGPDHp1和BnGPDHp2兩個子集，且這兩個子集間保守元件存在較大差異，推測BnGPDHp1和BnGPDHp2可能分別由AtGPDHp1和AtGPDHp2獨立進化而來，且存在一定的功能分化。

研究認為GPDHm主要與GPDHc協(xié)同作用維持細胞內(nèi)的G3P動態(tài)平衡并參與線粒體的能量代謝過程[12-13,15]，GPDHp則主要參與質(zhì)體脂類的合成，對種子含油量影響不大[11,16,20]，而GPDHc在細胞質(zhì)TAG合成過程中作用更為關(guān)鍵[6-7]。因此，本研究對BnGPDHc進行qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BnGPDHc的6個成員在21、30、40DAF的種子中的表達更為活躍，與劉少鋒等[34]的研究結(jié)果一致，油菜種子21DAF-40DAF是油分積累的關(guān)鍵時期，BnGPDHc的表達量提高可以促進G3P的合成，為TAG的合成提供充足的底物；研究還發(fā)現(xiàn)盡管BnGPDHc在光合器官葉片中的相對表達量較低，但BnGPDHc1-1、BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2這4個成員在角果發(fā)育前期的角果皮中的相對表達量卻較高，在水稻中的研究也發(fā)現(xiàn)OsGPDH1在生殖發(fā)育時期的劍葉中的表達量較高[18]，推測GPDH可能參與了角果皮、劍葉等光合作用(源)器官的形態(tài)建成；高、低含油量自交系材料不同組織器官qRT-PCR分析顯示21DAF 、30DAF種子中BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2的相對表達量在高、低含油量自交系中存在不同程度的差異，與Lu等[35]對高含油品系‘ZS11’和低含油量品系‘WH5557’ 34DAF種子子葉進行轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果相吻合，表明這些基因可能在油菜種子TAG合成中具有關(guān)鍵作用，可以作為油菜含油量改良的候選基因研究 利用。

本研究采用生物信息學分析的方法在甘藍型油菜基因組中共鑒定出18個BnGPDH基因，分為BnGPDHp、BnGPDHm和BnGPDHc3個亞家族，基因結(jié)構(gòu)及保守元件分析顯示亞家族內(nèi)的基因成員具有一定的保守性，亞家族間的成員具有較大差異，暗示亞家族間的基因存在功能分化，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2可能在油菜種子TAG合成中的作用更關(guān)鍵，這些結(jié)果為進一步利用這些基因進行油菜含油量改良奠定了基礎(chǔ)。