王東陽，楊燕燕，白薩日娜，納仁高娃，包圖雅

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院，呼和浩特 010031)

防御素作為抗菌肽的主要成分，能夠抵御外來病原體的感染，在免疫、預(yù)防生殖道感染及胎兒正常發(fā)育等方面起到重要作用[1]。山羊乳腺炎使β-防御素-3的表達(dá)量增加，說明β-防御素-3在乳腺炎發(fā)生和發(fā)展的過程中起重要作用[2]。在綿羊體內(nèi)有兩種β-防御素的表達(dá)，包括β-防御素-1 (SBD-1)和β-防御素-2(SBD-2)[3]，主要分布在生殖、消化、呼吸等各大系統(tǒng)[4-6]。在綿羊的陰道黏膜上皮、子宮頸、輸卵管等組織內(nèi)均存在SBD-1的廣泛表達(dá)。雌性生殖系統(tǒng)中β-防御素具有中和內(nèi)毒素活性、抑制補(bǔ)體系統(tǒng)和抵御病毒感染等多種功能[7]。而生殖系統(tǒng)內(nèi)β-防御素的表達(dá)與生理周期有關(guān)，主要受孕酮(P4)和雌二醇(E2)的調(diào)控[8]。P4具有調(diào)節(jié)輸卵管上皮細(xì)胞分泌的活性，同時也能夠促進(jìn)胚胎分裂及發(fā)育，為正常妊娠提供一個良好的環(huán)境[9]，P4可通過作用于LPS受體、TLR信號通路影響抗菌肽的表達(dá)[10]。研究發(fā)現(xiàn)P4對輸卵管上皮細(xì)胞SBD-2的表達(dá)主要通過核受體途徑和膜受體途徑介導(dǎo)，據(jù)此筆者推測P4影響SBD-1的表達(dá)也可能與這兩種途徑有關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身免疫和預(yù)防生殖道感染。

國內(nèi)外已有研究證實SBD-1在輸卵管上皮細(xì)胞表達(dá)[6,11]，但P4對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞SBD-1基因表達(dá)的調(diào)控及相關(guān)信號通路的研究較少。因此，本試驗通過體外培養(yǎng)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞，探究P4對SBD-1mRNA表達(dá)的影響，并用蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)及孕酮核受體(PR)信號通路的阻斷劑研究P4在SBD-1mRNA表達(dá)過程中的作用，以明確P4調(diào)節(jié)SBD-1mRNA表達(dá)的具體信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 在呼和浩特市屠宰場獲得間情期健康成年母綿羊。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12，Thermo公司產(chǎn)品；孕酮、RU-486(P4核受體阻斷劑)、H-7(PKC通路阻斷劑)、H-89(PKA通路阻斷劑)，Sigma公司產(chǎn)品；極速抽提總RNA試劑盒RNAfast200，上海聯(lián)邁生物工程有限公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Regent Kit、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMKit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng) 將屠宰后的綿羊迅速解剖并采集輸卵管組織，放入無Ca2+的PBS溶液，并在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到無菌實驗室，進(jìn)行如下處理：用無菌玻片輕輕刮除輸卵管周圍組織，去除輸卵管內(nèi)黏液，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇沖洗縱向剖開的輸卵管管腔，然后用PBS溶液洗滌3次，將輸卵管放入2%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基上，用無菌刀片輕刮，取下輸卵管內(nèi)面組織，用吸管輕輕分散細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，置于離心機(jī)中離心5 min (1 000 r/min)，用PBS溶液洗滌2次，重復(fù)離心，移除上清液，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中，將細(xì)胞懸液以10×105mL-1的濃度接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、φ=95%空氣、φ=5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，肉眼觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)試驗 原代細(xì)胞融合至80%～90%，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。然后在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10-8mol/L P4[12]，分別記錄不同時間(0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h)細(xì)胞的生長情況并收集細(xì)胞，分別提取總RNA。用無血清DMEM/F12洗滌傳代細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各處理組分別添加10-6mol/L RU-486、50 μmol/L H-7和50 μmol/L H-89信號通路阻斷劑。將綿羊輸卵管上皮細(xì)胞用信號通路阻斷劑預(yù)處理 1 h，確保每種通路阻斷劑的有效性，然后根據(jù)P4誘導(dǎo)SBD-1mRNA表達(dá)的最佳時間處理細(xì)胞，并設(shè)P4+阻斷劑組、阻斷劑組、P4組和對照(Control)組，均置于“1.2.1”所述條件下培養(yǎng)，研究SBD-1mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上公布的綿羊SBD-1基因和內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)序列(U75250，U39357)，設(shè)計引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 總RNA提取和cDNA的合成 按照RNAfast200試劑盒說明提取總RNA，然后按照Prime ScriptTMRT Regent Kit說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；蚪MDNA的去除反應(yīng)體系：gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser 2 μL，RNase free dH2O 6 μL，總RNA 1 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，然后置于4 ℃。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：5×Prime script buffer 2(for real time) 4 μL，Prime Script RT enzyme Mix 1 μL，RT Prime Mix 0.5 μL，RNase Free dH2O 4 μL，基因組DNA的去除反應(yīng)液10 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存，備用。

1.2.5 qPCR 按照SYBR Premix ExTaqTMKit的操作步驟，以cDNA產(chǎn)物為模板，利用iCycleriQTM5實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)檢測基因的相對表達(dá)量，每個樣品重復(fù)3次，反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，SYBR Premix ExTaqTM10 μL，上游引物(10 μmol/L)與下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，RNase Free dH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95.0 ℃ 1 min；95.0 ℃ 10 s，63.0 ℃20 s，72.0 ℃10 s，讀板，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。測定熔解曲線：初始溫度為70 ℃，每6 s增加0.5 ℃，直至95 ℃。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用IBM SPSS Statistics 19.0(美國IBM公司)中單因子方差(One -way ANOVA)中的最小顯著差數(shù)法(Least significant difference，LSD)程序分析數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct公式計算基因的相對表達(dá)量。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 P4對 SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中添加10-8mol/L P4，培養(yǎng)2 h、6 h、12 h、24 h、48 h，探究P4對SBD-1mRNA誘導(dǎo)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示(圖1)：2 h時，SBD-1mRNA的表達(dá)量與對照組無顯著性差異(P>0.05)；6 h時，SBD-1mRNA的表達(dá)量達(dá)到最高峰(P<0.01)，為SBD-1mRNA最大誘導(dǎo)量；12 h時，SBD-1mRNA表達(dá)量有所下降(P<0.05)；24 h與48 h時，SBD-1mRNA的表達(dá)量持續(xù)下降，與對照組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)量均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 RU-486對輸卵管上皮細(xì)胞 SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

使用P4核受體阻斷劑RU-486預(yù)處理培養(yǎng)細(xì)胞1 h，然后添加10-8mol/L P4，6 h后觀測SBD-1mRNA的表達(dá)量，探究RU-486對P4誘導(dǎo)SBD-1mRNA表達(dá)的作用。結(jié)果顯示：P4組與對照組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。RU-486+P4組與P4組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，表明SBD-1的表達(dá)與孕酮核受體有關(guān)。RU-486組與對照組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，表明RU-486未參與單獨(dú)誘導(dǎo)SBD-1mRNA的表達(dá)(圖2)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Different lowercase letters cindicate significant difference，P<0.05，the same below

圖1 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞通過孕酮不同處理時間影響SBD-1mRNA的表達(dá)
Fig.1 Effect of progesterone on expressions ofSBD-1mRNA in ovine oviduct epithelial cells at different processing times

圖2 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞通過RU-486影響 SBD-1 mRNA的表達(dá)Fig.2 Effect of RU-486 on the SBD-1 mRNA expressions in ovine oviduct epithelial cells

2.3 H-89對輸卵管上皮細(xì)胞中 SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

用PKA通路阻斷劑H-89預(yù)處理細(xì)胞1 h，再添加10-8mol/L P4，確定PKA信號通路是否參與P4誘導(dǎo)的SBD-1mRNA表達(dá)。6 h后結(jié)果顯示：與P4組比較，H-89+P4組SBD-1mRNA的表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，表明P4誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)與PKA通路激活有關(guān)。H-89組與對照組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，表明H-89單獨(dú)存在并不能誘導(dǎo)SBD-1mRNA的表達(dá)(圖3)。

圖3 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞通過H-89影響 SBD-1 mRNA的表達(dá)Fig.3 Effect of H-89 on the SBD-1 mRNA expressions in ovine oviduct epithelial cells

2.4 H-7對輸卵管上皮細(xì)胞中 SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

用PKC通路阻斷劑H-7預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后添加10-8mol/L P4，6 h后檢測SBD-1mRNA的表達(dá)量，確定PKC途徑是否介導(dǎo)P4誘導(dǎo)的SBD-1mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：H-7+P4組與P4組比較，SBD-1mRNA表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，表明H-7不參與SBD-1mRNA的表達(dá)，P4上調(diào)SBD-1mRNA的表達(dá)與PKC通路無關(guān)。H-7組與對照組比較，SBD-1mRNA的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，表明單獨(dú)應(yīng)用H-7可能會誘導(dǎo)SBD-1mRNA的表達(dá)(圖4)。

2.5 不同信號通路阻斷劑對P4誘導(dǎo) SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，10-8mol/L P4可顯著上調(diào)輸卵管上皮細(xì)胞SBD-1mRNA的表達(dá)(P<0.05)；與P4組相比，H-89+P4組SBD-1mRNA相對表達(dá)量顯著低于P4組(P<0.05)，說明H-89抑制P4對SBD-1mRNA的上調(diào)作用；RU-486+P4組SBD-1mRNA的相對表達(dá)量顯著低于P4組 (P<0.05)，表明RU-486可抑制P4對SBD-1mRNA的上調(diào)表達(dá)，且抑制效果為H-89> RU-486(圖5)。而H-7+P4組與P4組SBD-1mRNA的表達(dá)量無顯著性差異(P> 0.05)，表明P4對SBD-1mRNA的誘導(dǎo)可能不存在PKC 通路。

圖4 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞通過H-7影響 SBD-1 mRNA的表達(dá)Fig.4 Effect of H-7 on the SBD-1 mRNA expressions in ovine oviduct epithelial cells

圖5 不同信號通路阻斷劑影響孕酮誘導(dǎo) SBD-1 mRNA的表達(dá)Fig.5 Effect of various antagonists on SBD-1 mRNA transcription induced by progesterone

3 討 論

防御素作為抗菌肽的主要成分，對原核、真核病原體及病毒具有較強(qiáng)的殺菌活性[13]，可在適應(yīng)性免疫啟動前控制感染，也可作為獲得性免疫的中介，刺激抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)[14-15]。在哺乳動物生殖系統(tǒng)中P4對β-防御素表達(dá)的調(diào)控成為近年研究的新熱點(diǎn)。P4可以降低脂多糖介導(dǎo)的炎性因子的釋放，能夠上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素的表達(dá)[16-17]，其具體調(diào)控機(jī)制有待研究，本研究通過使用P4處理體外培養(yǎng)細(xì)胞，添加相應(yīng)信號通路阻斷劑，進(jìn)而檢測SBD-1mRNA的表達(dá)，以明確P4調(diào)節(jié)SBD-1mRNA表達(dá)的具體信號通路。

P4與孕酮受體(PR)結(jié)合，主要通過基因組途徑(核受體途徑)和非基因組途徑(膜受體途徑)兩種主要機(jī)制作用于其靶細(xì)胞。在基因組途徑中，P4的生物學(xué)作用由核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族的PR介導(dǎo)[18-19]。P4與核受體結(jié)合后使其構(gòu)象發(fā)生變化，引發(fā)寡聚復(fù)合體的分離、易位，并與靶基因的孕酮應(yīng)答元件(PRES)結(jié)合調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[20]。而細(xì)胞內(nèi)多種信號通路及蛋白激酶介導(dǎo)膜受體途徑，從而調(diào)控P4對輸卵管上皮細(xì)胞SBD-1mRNA的表達(dá)，與基因組途徑相比，非基因組途徑作用迅速，這和信號級聯(lián)蛋白激活第二信使和激酶，以及P4與膜受體(mPR)的相互作用有關(guān)[21]。P4通過激活腺苷酸環(huán)化酶提高cAMP含量，從而激活PKA通路，這個過程涉及到Ca2+的內(nèi)流[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞存在SBD-1mRNA的表達(dá)，P4能顯著增加SBD-1mRNA的表達(dá)量，并且P4誘導(dǎo)其表達(dá)呈時間依賴性，在6 h時SBD-1mRNA的表達(dá)量最高，隨后表達(dá)上調(diào)水平逐漸下降(圖1)。在未添加P4的培養(yǎng)細(xì)胞中仍能檢測到SBD-1mRNA的表達(dá)，這說明β-防御素是生殖系統(tǒng)先天性免疫系統(tǒng)的成分，P4并不是使其分泌的唯一因素，但加入P4后可以上調(diào)SBD-1mRNA的表達(dá)水平。

本研究中不同信號通路阻斷劑在培養(yǎng)6 h時對比發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)加入P4能顯著增加SBD-1mRNA的表達(dá)；RU-486+P4組與P4組相比，SBD-1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，阻斷P4核受體后，RU-486顯著抑制P4對SBD-1mRNA表達(dá)的上調(diào)作用(P<0.05)，而與對照組相比，RU-486組SBD-1mRNA的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。這表明RU-486對SBD-1mRNA表達(dá)本身無明顯影響，但可通過阻斷孕酮核受體抑制P4對SBD-1mRNA表達(dá)的上調(diào)作用。P4的生理作用是通過與孕酮核受體(PR)結(jié)合，激活PR基因表達(dá)，從而調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的生物合成。RU-486能夠使P4下調(diào)白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)的作用降低[23]，P4能有效抑制TLR-4的表達(dá)，而添加RU-486后這種抑制作用減弱，這種抑制作用可能與P4作用于糖皮質(zhì)激素受體和孕酮核受體有關(guān)[24]。阻斷PKA信號通路后P4對SBD-1mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；而PKC阻斷劑H-7對SBD-1mRNA的表達(dá)無影響(圖3、圖4)。這可能與P4和膜受體結(jié)合，通過cAMP激活絲裂原活化蛋白激酶調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)[25]。以上結(jié)果表明，P4對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞SBD-1mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)作用不僅受孕酮核受體信號通路作用，而且也受孕酮膜受體的影響。PKA信號通路可能參與SBD-1mRNA的表達(dá)，PKC信號通路不參與SBD-1mRNA的表達(dá)，而有研究報道HBD-2的表達(dá)受PKC途徑的調(diào)控[26]。

圖5顯示，對P4誘導(dǎo)SBD-1mRNA表達(dá)的阻斷效果為H-89優(yōu)于RU-486，而H-7影響最小。P4膜受體阻斷劑通過非基因組途徑起到快速的調(diào)節(jié)作用，而P4與核受體結(jié)合后需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，而轉(zhuǎn)錄mRNA及合成蛋白質(zhì)的過程需要數(shù)小時，這可能是6 h時膜受體阻斷劑的阻斷效果更好的原因[27-28]。

綜上所述，綿羊輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素的表達(dá)受激素水平的調(diào)節(jié)，而P4對輸卵管上皮細(xì)胞SBD-1mRNA的表達(dá)也受不同時間的影響，其調(diào)控機(jī)制主要涉及核受體途徑(PR)和膜受體途徑(PKA)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索防御素表達(dá)的信號通路及機(jī)制提供基礎(chǔ)，同時為合理使用生殖相關(guān)藥物提供依據(jù)。