竇麗麗，陶曉莉，王曉芳，李婷婷，李永剛

近年來(lái)，我國(guó)新發(fā)現(xiàn)了一種新型布尼亞病毒，經(jīng)蜱傳播，其臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、血小板和白細(xì)胞減少、胃腸道癥狀以及淋巴結(jié)腫大，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起器官衰竭，故將此病毒命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒，該病毒引起的疾病稱為嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少癥(SFTS)，是一種人獸共患病[1]。該病毒被世界衛(wèi)生組織列為引起嚴(yán)重發(fā)熱的最危險(xiǎn)病原體,其死亡率為12%～30%，同時(shí)伴有特征性血小板減少癥[2]。然而，目前還沒有針對(duì)此種病毒的抗病毒藥物或者疫苗，另外該病毒在人類中的發(fā)病機(jī)制及病毒與宿主的相互作用在很大程度上仍未可知[3]。布尼亞病毒是最大的動(dòng)物病毒家族之一，大約有350種病毒，其中大多數(shù)是蟲媒病毒，由節(jié)肢動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物傳播。不同的布尼亞病毒感染者表現(xiàn)出一系列輕度至重度疾病，即發(fā)熱性疾病，腦炎，出血熱和急性呼吸道疾病[1]。 由于宿主的廣泛性和物種的多樣性，布尼亞病毒引起了廣泛的關(guān)注。

研究表明，SFTSV-NSs是一個(gè)強(qiáng)的干擾素(IFN)拮抗劑，其可以阻斷SFTSV感染細(xì)胞中IFN生成并且NSs是病毒毒力的主要決定因素[4-9]。一些專家學(xué)者嘗試產(chǎn)生缺乏NSs結(jié)構(gòu)的缺陷型病毒以促進(jìn)該發(fā)病機(jī)理的研究及開發(fā)新的候選疫苗，以防止這種重要的新興病原體的傳播。NSs在SFTSV病毒復(fù)制周期中具有重要作用，而該病毒在人類中的發(fā)病機(jī)制及病毒與宿主的相互作用仍不十分明確，本研究通過克隆SFTSV-NSs基因，構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒以及檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究SFTSV-NSs基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1病毒與細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用的SFTSV由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物所饋贈(zèng)，293細(xì)胞株購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.1.2主要試劑 內(nèi)切酶EcoRI酶、XhoⅠ酶(Thermo Scientific)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等(TaKaRa 公司)；TRIzol Reagent LS(Ambion)；質(zhì)粒DNA中量試劑盒(美國(guó)Axyprep公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；抗FLAG單克隆抗體(Sigma公司)；Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)、HRP-goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen公司)等。

1.2 SFTSV-NSs基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank提供的SFTSV-NSs序列，運(yùn)用Premier 5.0軟件，進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，選取合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)真核表達(dá)重組質(zhì)粒的引物見表1。

表1 新布尼亞病毒SFTSV-NSs基因真核表達(dá)引物
Tab.1 Eukrainian virus SFTSV-NSs gene eukaryotic expression primer

名稱序列產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpSFTSV-NSs R(BamHI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877SFTSV-NSs F(EcoRI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877

注：設(shè)計(jì)好的引物由大連寶生物公司合成，純化級(jí)別為PAGE級(jí)。

1.2.2SFTSV RNA的提取及SFTSV-NSs基因PCR 擴(kuò)增 SFTSV RNA按照Invitrogen公司的TRIzol Reagent LS 試劑說(shuō)明書進(jìn)行的提取，后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA。通過PCR 擴(kuò)增得SFTSV-NSs基因。PCR 程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸65 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3重組質(zhì)粒pSFTSV-NSs-FLAG構(gòu)建和鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行通過純化試劑盒進(jìn)行純化，并取適量PCR純化產(chǎn)物送去公司測(cè)序。將純化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段連接到pFLAG-CMV-3載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞選擇生長(zhǎng)良好的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒中量提取，并用分光光度儀測(cè)定提取的質(zhì)粒濃度，將提取的重組質(zhì)粒用EcoRI/BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.3pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞293及相關(guān)檢測(cè)

1.3.1293細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將293細(xì)胞以4×105/孔的密度接種到置有爬片的24孔板中，加入配好的含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日每孔用50 μL Opti-MEM稀釋2 μL PEI轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸3～5次混合均勻，室溫放置5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒0.8 μg，同時(shí)稀釋空載體pFLAG-CMV-3設(shè)置為對(duì)照組；將稀釋好的質(zhì)粒與空載體分別加入到PEI稀釋液中，室溫放置20 min。將混合液逐滴加入到24孔板中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別進(jìn)行間接免疫熒光及Western Blot檢測(cè)。

1.3.2免疫熒光檢測(cè) 293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒48 h后，用4%多聚甲醛固定液固定1 h，PBS洗滌3次。然后0.1% Triton X-100打孔10 min，用PBS洗滌3次后再加入含2% FBS的PBS封閉液，4 ℃封閉2 h。用PBS洗滌3次后加入小鼠抗FLAG抗體，37 ℃孵育1 h。吸掉一抗稀釋液，用PBS洗滌3次，加入二抗Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL DAPI溶液室溫孵育5 min，PBS洗滌3次，用甘油進(jìn)行封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中SFTSV-NSs蛋白表達(dá) 用細(xì)胞裂解液NP-40提取轉(zhuǎn)染后293細(xì)胞的總蛋白，加入 4×蛋白上樣緩沖液置于沸水浴中加熱10 min進(jìn)行蛋白變性，所得樣本收集置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?。蛋白樣品回收后轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h; 將小鼠抗FLAG抗體用1∶5 000比例稀釋，4 ℃ 搖床孵育過夜; 然后用洗膜液5 min/次洗膜3次。再以1∶3 000的比例稀釋HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)作為二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，再用洗膜液5 min/次洗膜3次。最后用化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)PVDF膜上SFTSV-NSs蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1SFTSV-NSs基因擴(kuò)增序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1，在877 bp左右有條帶，與預(yù)期SFTSV-NSs基因大小一致，因此判斷SFTSV-NSs真核表達(dá)基因擴(kuò)增成功，且條帶單一，可以進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

注：1和2均為SFTSV-NSs目的片段圖1 SFTSV-NSs基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 SFTSV-NSs gene PCR product electrophoresis results

2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序鑒定 用EcoRI/BamHI雙酶切真核PCR純化產(chǎn)物和空載體pFLAG-CMV-3質(zhì)粒，回收目的片段并連接，用EcoRI/BamHI雙酶切鑒定。電泳顯示有和預(yù)期大小一致的酶切片段，證明pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

注：1和2均為pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒圖2 EcoRI/BamHI雙酶切pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒Fig.2 EcoRI/BamHI double digestion of pSFTSV-NSs-FLAG plasmid

2.3免疫熒光檢測(cè)SFTSV-NSs基因在293細(xì)胞中的定位 pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，以抗FLAG標(biāo)簽的單克隆抗體為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢測(cè)到熒光聚集的類包涵體樣結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)；而轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-3空載體的細(xì)胞未檢測(cè)到熒光標(biāo)記。

注：A為轉(zhuǎn)染空載體pFLAG-CMV-3；B為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSFTSV-NSs-FLAG圖3 pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)(200×)Fig.3 Indirect immunofluorescence detection of pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells (200×)

2.4Western blot 鑒定目的蛋白在293細(xì)胞中的表達(dá) pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。由圖可見pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取總蛋白的泳道中在約33 kD處有特異性條帶出現(xiàn)，與SFTSV-NSs蛋白預(yù)期大小一致，而轉(zhuǎn)染空載體pFLAG-CMV-3的泳道則沒有條帶。

注：1為轉(zhuǎn)染空載體；2-4為轉(zhuǎn)染pSFTSV-NSs-FLAG質(zhì)粒圖4 pSFTSV-NSs-FLAG轉(zhuǎn)染細(xì)胞Western Blot檢測(cè)Fig.4 pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells were detected by Western Blot

3 討 論

布尼亞病毒之所以種類繁多，是由于其基因組的分節(jié)段特性，利于病毒發(fā)生基因重排和基因重組，既可對(duì)變化的環(huán)境獲得適應(yīng)性突變，也可快速產(chǎn)生新病毒，增加致病性?；蛑嘏藕突蛑亟M本質(zhì)上增大了布尼亞病毒對(duì)宿主的危害，為布尼亞病毒診斷、預(yù)防及控制加大了難度，從而對(duì)人類公共衛(wèi)生造成了更大的威脅[10-12]。因此，對(duì)重要的布尼亞病毒要求進(jìn)行深入研究，探究其遺傳機(jī)制、傳播機(jī)制及驅(qū)動(dòng)基因重排的機(jī)理，從而為此類病毒的預(yù)防與控制提供理論基礎(chǔ)。

SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，直徑80～100 nm，由厚度5～7 nm的脂質(zhì)雙層覆蓋，其表面有棘突。與其他白蛉屬病毒類似，SFTSV基因組分為L(zhǎng)、M、S 3個(gè)片段，S片段編碼核蛋白(NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)[13]。Brennan B等[14]發(fā)現(xiàn)SFTSV病毒致病性的增強(qiáng)是由于NSs對(duì)先天免疫反應(yīng)的拮抗作用，并且他們進(jìn)一步證實(shí)編碼NSs核苷酸序列的某些部分對(duì)于重組病毒的回收可能是至關(guān)重要的。在體內(nèi)環(huán)境中，SFTSV-NSs拮抗IFN反應(yīng)的能力可能限于I型干擾素誘導(dǎo)和信號(hào)傳導(dǎo)。NSs蛋白可以在感染和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中形成病毒樣結(jié)構(gòu)(VLS),受感染細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白可能與病毒RNA相互作用[15]。本研究通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建的病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)也觀察到類包涵體樣結(jié)構(gòu)，與其研究結(jié)果一致。以上數(shù)據(jù)表明NSs也可能在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用[17]。另外，有研究表明，NSs蛋白可能在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建SFTSV-NSs真核表達(dá)體 pSFTSV-NSs-FLAG并將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)而通過研究重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究SFTSV-NSs基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，以期為研究SFTSV在感染細(xì)胞過程中與宿主的相互作用提供新思路。

利益沖突：無(wú)