劉 淦，胡婷婷，陶東東，柳發(fā)虎，楊進(jìn)孫，孫恩濤

腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是人獸共患傳染性疾病，由漢坦病毒屬(Hanta-viruses)各型病毒感染引起，主要是鼠類等嚙齒動(dòng)物通過排泄物、直接接觸人體等途徑傳播致病[1-2]。在中國(guó)，HFRS是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年發(fā)病人數(shù)約占據(jù)全球90%的比例，我國(guó)陜西、河北及山東地區(qū)等都是腎綜合征出血熱的多發(fā)疫區(qū)[3-6]。人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)基因復(fù)合體位于人類第6號(hào)染色體，經(jīng)典HLA-I基因具有高度多態(tài)性，亦是參與機(jī)體免疫的候選基因組之一，通過抗原肽呈遞CD8+T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，在免疫識(shí)別病原體感染的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)表位與宿主免疫系統(tǒng)之間的各種相互作用[7-8]。傳染性和炎性疾病已在HLA中顯示出很強(qiáng)的遺傳關(guān)聯(lián)，有研究表明，HFRS是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用產(chǎn)生，且具有明顯的遺傳傾向，HLA基因與HFRS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系在國(guó)內(nèi)已有報(bào)道[9-10]。因此，研究疾病的同時(shí)還應(yīng)需要考慮宿主HLA的遺傳背景。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)通常是最常見的基因組變異，目前已成為研究基因組區(qū)域遺傳的理想選擇，通過DNA中的遺傳信息被轉(zhuǎn)錄為RNA，然后翻譯為蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)確定人類之間的差異，SNP可分析基因型和表型信息之間的關(guān)系，因此遺傳多態(tài)性間接影響免疫等生理活動(dòng)[11]。李琦等[12]篩查河北省HFRS患者HLA功能性基因位點(diǎn)，采用病例對(duì)照方法分析HLA基因位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)更易感染HFRS，但選擇人群分布具有差異。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，首次探討HLA-B基因位點(diǎn)與皖南地區(qū)HFRS的關(guān)聯(lián)，提供HFRS發(fā)病機(jī)制的科學(xué)依據(jù)，為臨床前期篩查提供指導(dǎo)方向。

1 材料與方法

1.1材料收集 兩組人群均來(lái)源于2018年9月1日至2019年9月1日安徽蕪湖弋磯山醫(yī)院。病例組：患者均根據(jù)國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)診斷為腎綜合征出血熱[11]，其中男性12例、女性2例, 年齡在27～74歲范圍內(nèi)，平均年齡(48.86±16.30)歲,且均為漢族人群。對(duì)照組：根據(jù)年齡、性別、職業(yè)等基線資料，從醫(yī)院體檢中心隨機(jī)抽取不患目標(biāo)疾病的人群作為健康對(duì)照，隨機(jī)選取50名漢族地區(qū)正常人(無(wú)腎綜合征出血熱發(fā)病史、或接種相關(guān)疫苗)，且各生化成分及各細(xì)胞含量均處于正常范圍，其中男25例、女25例，年齡在27～74歲范圍內(nèi)，平均年齡(48.82±10.23)歲，且均為漢族人群，兩組人群資料經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)收集。兩組各留取新鮮抗凝血24 h內(nèi)操作，或置于—80 ℃冰箱內(nèi)冰凍保存后續(xù)操作。

1.2試劑與設(shè)備 腎綜合征出血熱漢坦病毒IgG抗體(HV-IgG)ELISA定性檢測(cè)試劑盒(南京帕爾斯生物科技有限公司)，Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek)，小型磁力架(上海生工)，磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)，Taq多聚酶(上海生工)，離心機(jī)(Eppendorf 5430/R)，PCR儀(Eppendorf)EPS-100核酸電泳儀Power Supply(上海天能Tanon)、通用型化學(xué)發(fā)光、熒光和可見光成像系統(tǒng)FluorChem FC3(美國(guó)Protein Simple公司)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 將采集的血液樣本實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行ELISA試劑檢測(cè)，以保證所得樣本準(zhǔn)確性，確診后的樣本留作DNA提取，采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒法提取白細(xì)胞基因組DNA，置于—20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物的設(shè)計(jì)與合成 參照李琦等[12]針對(duì)HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)的特異性堿基序列。引物：上游引物F1(5′-CACAGTGCAGCTCACTCAGC-3′)、上游引物F2(5′-CACAGTGCAGCTCACTCAGG-3′)和下游通用引物RP(5′-TGGTGGTCTACCCTTGGA-3′)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.3PCR擴(kuò)增分型 采用ASP-PCR技術(shù)擴(kuò)增HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)的186 bp片段。反應(yīng)體系為：基因組DNA3.5 μL，Taq酶0.4 μL(5 U/μL)，dNTP0.1 μL(10 mmol/L)，5×buffer (含Mg2+)4 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/ L)，無(wú)酶dd H2O 10 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。

1.3.4PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè) 取5.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在電壓100 V，35 min下用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下記錄結(jié)果。

1.3.5電泳結(jié)果判斷 若F1擴(kuò)增出來(lái)，而引物F2沒有，則此位點(diǎn)的等位基因W/W為純合子。若F2擴(kuò)增出來(lái)，而引物F1沒有，則此位點(diǎn)的等位基因M/M為純合子。若兩個(gè)引物F1、F2都擴(kuò)增出條帶，則此位點(diǎn)的等位基因W/M為雜合子。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg，H-W)遺傳平衡檢驗(yàn)，判斷所選人群是否具有代表性。兩組基因分布差異采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料，使用logistic回歸模型和95%可信區(qū)間(CI)評(píng)估兩組數(shù)據(jù)的危險(xiǎn)度(OR)，并建立加性、隱性和顯性遺傳模式，所有統(tǒng)計(jì)過程均使用雙側(cè)檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1ELISA試驗(yàn) ELISA試驗(yàn)檢測(cè)患者組樣本均為陽(yáng)性，對(duì)照組樣本均為陰性，檢測(cè)后樣本進(jìn)行DNA提取。

2.2基因位點(diǎn)分型 基因組DNA電泳出現(xiàn)的條帶清晰，完整且無(wú)缺損，長(zhǎng)度均超過2 000 bp。將其用于HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)分型，規(guī)定從左向右開始計(jì)數(shù)條帶泳道，起始為第1道,共25道電泳。

注：第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12路徑是G等位基因特異性引物PCR的結(jié)果；第14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25路徑是C等位基因特異性引物PCR的結(jié)果；第1和14、2和15、3和16、4和17、5和18、6和19、7和20、8和21、9和22、10和23、11和24、12和25為同一基因樣本；DNA標(biāo)志物：2 000 bp Marker。圖1 HLA-B基因rs34933313分型引物的電泳PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoretic PCR products of HLA-B gene rs34933313 typing primers

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1哈德溫伯格平衡檢驗(yàn) HLA-B基因rs3493331位點(diǎn)的等位基因?yàn)镚/C兩種形式，野生型為G、變異型為C，則可分為GG、CG、CC 3種基因型。利用哈溫平衡定律HLA-B rs34933313位點(diǎn)的對(duì)照組觀察人群檢驗(yàn)，此位點(diǎn)實(shí)際人群分布基因型頻率與預(yù)期人群分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明對(duì)照組研究樣本均都具有群體代表性，見表1。

表1 對(duì)照人群分布哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)
Tab.1 Hadwinberg equilibrium test among Distribution of control population

對(duì)照人群分布SNPGGn(%)CGn(%)CCn(%)χ2值P值實(shí)際分布22(44.00)24(48.00)4(8.00)0.220.9預(yù)期分布23(46.00)22(44.00)5(10.00)

2.3.2HLA-B rs34933313位點(diǎn)與腎綜合征出血熱易感性分析 經(jīng)過Hardy-Weinber平衡檢驗(yàn)HLA-B rs34933313滿足遺傳平衡、具有群體代表性，得出等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.38，P<0.05)，顯示攜帶C等位基因可增加HFRS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.45，P<0.05)。HLA-B基因SNP rs34933313的基因型頻率在病例組和對(duì)照組之間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.47，P<0.05)(見表2、3)。

表2 HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)等位基因頻率分布[例(%)]
Tab.2 Allele frequency distribution of HLA-B rs34933313 [cases (%)]

組別等位基因GCχ2值P值OR病例組n(%)13(46.43)15(53.57)4.380.042.45對(duì)照組n(%)68(68.00)32(32.00)

表3 HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)基因型頻率分布[例(%)]
Tab.3 Genotype frequency distribution of HLA-B rs34933313 locus [cases (%)]

組別基因型GGGCCCχ2值P值病例組n(%)1(7.14)11(78.57)2(14.29)6.470.04對(duì)照組n(%)22(48.00)24(8.00)4(11.00)

2.3.3不同遺傳模型HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)比較 對(duì)上述基因趨勢(shì)P<0.05的SNP位點(diǎn)作進(jìn)一步分析。從遺傳模型分析(表4)：加性模型：GG Vs CC、隱性模型：CC Vs GG+GC，顯性模型：CC+GC Vs GG。HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)基因型的加性模型(GG Vs CC)的OR值是11.00(95%CI=0.80～152.04)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隱性模型(CC Vs GG+GC)的OR值是1.91(95%CI=0.31～11.74)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；顯性模型(CC+GC VsGG)的OR值是10.21(95%CI=1.24～84.18)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 HLA-B rs34933313位點(diǎn)基因型在不同遺傳模型下的比較
Tab.4 Comparison of HLA-B rs34933313 genotypes in different genetic models

遺傳模型基因型病例組n(%)對(duì)照組n(%)OR值95%CIχ2值P值加性模型CC2(66.67)4(15.38)11.000.80～152.04-0.10①GG1(33.33)22(84.62)1-隱性模型CC2(14.29)4(8.00)1.920.31～11.740.040.85②GC+GG12(85.71)46(92.00)1-顯性模型CC+GC13(92.86)28(56.00)10.211.24～84.186.450.01GG1(7.14)22(44.00)1-

①Fisher精確概率法，②連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)

3 討 論

HFRS是一種人獸共患性傳染病，臨床特征是發(fā)熱、低血壓休克、充血出血，隨著時(shí)間的推移會(huì)嚴(yán)重?fù)p害腎臟等[13]。基因與環(huán)境因素共同作用和調(diào)控導(dǎo)致HFRS發(fā)生，其潛在機(jī)制亦與免疫反應(yīng)有關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)免疫因子的釋放可影響炎癥期間細(xì)胞因子含量調(diào)節(jié)，影響漢坦病毒感染，另外HFRS誘發(fā)與宿主基因差異有關(guān)，提示應(yīng)重視寄生宿主發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的本質(zhì)[15]。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是基因分型的常用方法，全外顯子測(cè)序(Whole Exon Sequencing，WES)的應(yīng)用可篩查突變基因位點(diǎn)，有助于更多傳染性疾病的遺傳因素的研究[16-17]。

HLA基因多態(tài)性與HFRS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)多有報(bào)道，顯示出兩者之間有緊密聯(lián)系。秦娜琳等[18]發(fā)現(xiàn)HLA-A*3101、HLA-B*5801、HLA-DRB1*1602基因位點(diǎn)可增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，HLA-B*4001作為保護(hù)因素，但基因型攜帶的患者數(shù)量較少。CTL在HFRS過程發(fā)揮重要作用，保護(hù)性基因的表達(dá)產(chǎn)物介導(dǎo)CTL具有較強(qiáng)效應(yīng)能力，抵抗疾病發(fā)生，反之易感性基因表達(dá)蛋白使抗原提呈不足等，使CTL功能減退或消失，導(dǎo)致免疫功能損傷使疾病易感[19]。HLA基因多態(tài)性與HFRS的易發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及病程嚴(yán)重度有關(guān)，深入對(duì)HLA基因位點(diǎn)及單倍型的關(guān)系研究可協(xié)助臨床早期篩查及診斷[20]。通過對(duì)漢坦病毒(Hantaan virus，HTNV)感染下的不同臨床病程HFRS患者分析，發(fā)現(xiàn)HFRS嚴(yán)重臨床進(jìn)程與患者所攜帶的HLA-B*46基因位點(diǎn)、單倍型HLA-B*46-DRB1*09和HLA-B*51-DRB1*09有關(guān)，同時(shí)患有輕度臨床進(jìn)程的患者中HLA-DRB1*12等位基因出現(xiàn)頻率較高，提示此位點(diǎn)可能是保護(hù)因素，說(shuō)明了HLA基因與HFRS的易感性有顯著相關(guān)性，為往后HLA基因多態(tài)性對(duì)HFRS研究開展提供新的理論方向[21-22]。

本研究結(jié)果顯示HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)病例組GC基因型頻率明顯高于對(duì)照組，提示HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)GC基因型可能與HFRS相關(guān)。病例組C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，且攜帶C等位基因罹患HFRS的概率是G等位基因的2.45倍，會(huì)增加HFRS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，猜測(cè)在遺傳信息表達(dá)過程中該位點(diǎn)G突變?yōu)镃導(dǎo)致氨基酸替換或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致編碼免疫蛋白的改變，從而產(chǎn)生對(duì)疾病的易感性。提示皖南地區(qū)漢族人群HLA-B基因rs34933313位點(diǎn)與HFRS患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。但本研究篩選樣本數(shù)量有限，并且覆蓋人群僅在皖南地區(qū)，具有一定的局限性，下一步將擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究，并尋求更多HLA-B易感基因位點(diǎn)，深入對(duì)HFRS遺傳易感性的相關(guān)機(jī)制的研究。

利益沖突：無(wú)