祁雷磊，張麗娟，周冰瑩，宋豎旗，盧建新，尹學(xué)來(lái)，龐 然

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患者健康。在世界范圍內(nèi)該病目前已經(jīng)位居男性惡性腫瘤的第二位，并成為腫瘤所造成的男性死亡原因的第六位[1-2]。在中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)均呈顯著上升趨勢(shì)[3]。隨著藥物研發(fā)和治療理念的進(jìn)展，對(duì)于前列腺癌目前具有許多新型藥物和豐富的治療手段。然而，無(wú)論是手術(shù)治療，放、化療，或是內(nèi)分泌治療均存在一定的治療副反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4-6]。中醫(yī)藥在腫瘤治療中具有重要角色，前列消癥湯為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院劉猷枋教授治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究結(jié)果顯示，該方不僅能夠顯著改善晚期前列腺癌患者的生活質(zhì)量，還能夠延緩去勢(shì)抵抗性前列腺患者的臨床進(jìn)展[7-8]?，F(xiàn)為進(jìn)一步探索前列消癥湯治療前列腺癌的療效機(jī)制進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 DU-145細(xì)胞，購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源中心，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所（STR信息：Amelogenin：X；CSF1PO：11；D13S317：11；D16S539：11；D18S51：14，15；D19S433：14；D21S11：29，31.2；D2S1338：18，20；D3S1358：16；D5S818：13；D7S820：8）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 凱基細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)凱基生物科技發(fā)展有限公司、Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司、MTT購(gòu)置美國(guó)Sigma公司、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司、0.25%胰酶消化液+0.02%乙二胺四乙酸（Edetic acid disodium salt，EDTA）購(gòu)自中國(guó)吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)耗材及儀器 流式管購(gòu)自美國(guó) BD公司、Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)Millipore公司、FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)置美國(guó)BD公司、2020冰點(diǎn)滲透壓儀購(gòu)自美國(guó)ADVANCED公司、PHS-2F酸度計(jì)購(gòu)自中國(guó)上海雷磁儀器廠、DZF-6020真空干燥箱購(gòu)自中國(guó)上海一恒科技有限公司、RE 52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自中國(guó)上海亞榮生化儀器廠。

1.4 藥物制備 前列消癥湯（組方：黃芪20 g，生薏苡仁30 g，莪術(shù)10 g，土貝母10 g，豬苓10 g，白花蛇舌草20 g，黃精20 g）取上述中藥劑量的4倍，一半置煎煮容器內(nèi)，量筒量取10倍劑量的雙蒸水浸泡半小時(shí)，然后煮沸，開小火熬2 h，過濾藥渣倒出藥液，然后將另一半中藥用10倍量乙醇煎煮，煎沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，合并2次濾液。將藥液倒于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器瓶?jī)?nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成膏劑，然后取出倒入盆內(nèi)，置于真空干燥箱干燥48 h，進(jìn)行真空干燥，然后將干燥的固體研磨成粉劑，用培養(yǎng)液分別配置成所需的濃度，低劑量組為10 mg·L-1，中劑量組為 30 mg·L-1，高劑量組為100 mg·L-1，用0.2 μm濾器過濾，分裝至50 mL離心管中保存。然后測(cè)定最大濃度的前列消癥湯培養(yǎng)液的pH值及滲透壓。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前列消癥湯對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞周期分布的影響 將處于快速生長(zhǎng)期的DU-145細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為高、中、低劑量含前列消癥湯藥物培養(yǎng)液以及正常培養(yǎng)液作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h；24 h后取出各組細(xì)胞，經(jīng)PBS潤(rùn)洗、胰酶消化、離心處理后的細(xì)胞重懸于預(yù)冷的PBS緩沖液中，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL；各組分別取1 mL細(xì)胞懸液至流式管，將各組流式管置于震蕩器上部，然后在震蕩的同時(shí)緩緩滴入預(yù)冷的無(wú)水乙醇3 mL，-20℃過夜以充分固定；取出固定于-20℃冰箱的各組細(xì)胞后，于低速離心機(jī)800 r/min離心5 min；各組加入100 μL RNase酶，然后放置在37℃水浴中孵育30 min；水浴后取出試管，在避光條件下，各管加入400μL試劑盒中 PI染色液，振蕩器上搖勻后4℃避光孵育30 min；過目后，將上述樣本于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處熒光值。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前列消癥湯對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞凋亡的影響 將處于快速生長(zhǎng)期的DU-145細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為高、中、低劑量含前列消癥湯藥物培養(yǎng)液以及正常培養(yǎng)液作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h；24 h后取出各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS潤(rùn)洗一遍，加入不含EDTA的酶消化液消化2 min，加入培養(yǎng)基（含10% FBS）1 mL以終止消化，吹勻后再次離心；向各組細(xì)胞中加入預(yù)冷1×Binding buffer （用超純水將l0× Binding buffer稀釋10倍）重懸，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，離心后，加入1mL 1×Binding buffer重懸，取l00μL細(xì)胞懸液至新流式管中。每個(gè)流式管中加入5μL AV避光孵育5 min，然后再分別向各流式管中加入5μL PI染色液，室溫避光孵育10 min；孵育完成后，分別向各管中補(bǔ)充l×Binding buffer 300μL，振蕩器上混勻避光保存，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡情況（上機(jī)前用300目過濾）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）。當(dāng)方差分析結(jié)果存在顯著性差異時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)同時(shí)滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，選用LSD-t法；同時(shí)滿足正態(tài)性和方差不齊選用 Dunnett' s 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MTT實(shí)驗(yàn)中的最大劑量1920μg/mL藥液用酸度計(jì)及冰點(diǎn)滲透壓儀器測(cè)定三次，取平均值，結(jié)果顯示pH值為6.91±0.07，參考DMEM/F12（加入NaHCO2）說(shuō)明書，在正常范圍6.6～7.2。滲透壓為：285.673±5.057，在正常范圍滲透壓274～302 mOsm/kgH2O 內(nèi)。

MTT實(shí)驗(yàn)方法均顯示前列消癥湯能夠抑制DU-145細(xì)胞增殖，其IC50大約為830μg/mL，因此本研究中的中劑量濃度均采用此濃度，高濃度采用2倍IC50，大約為1 660μg/mL，低濃度采用1/2倍IC50，大約為415μg/mL。

2.1 前列消癥湯各劑量組對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡影響 前列消癥湯低劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面與對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。中劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，中劑量組早期+晚期凋亡與對(duì)照組相比，亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。高劑量組在早期凋亡、晚期凋亡方面表現(xiàn)為進(jìn)一步增加，與對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。同時(shí)，高劑量組早期+晚期凋亡與對(duì)照組比較，也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見圖1、表1。

表1 不同濃度前列消癥湯對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響

圖1 各劑量組前列消癥湯對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響

2.2 前列消癥湯各劑量組對(duì)DU-145細(xì)胞周期的影響 對(duì)照組與低劑量組的S期細(xì)胞比例分別為（31.69±1.29）%、（31.51±2.61）%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；對(duì)照組與中劑量組的S期細(xì)胞比例分別為（31.69±1.29）%、（37.96±2.24）%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組與高劑量組的S期細(xì)胞比例分別為（31.69±1.29）%、（43.77±2.48）%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、表 2。

表2 不同濃度前列消癥湯對(duì)DU-145細(xì)胞周期影響

圖2 各劑量組前列消癥湯對(duì)DU-145細(xì)胞周期的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡，在1972年由Kerr、Wyllie和Currie三人首次提出?，F(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中具有重要的作用。細(xì)胞凋亡是個(gè)復(fù)雜的過程，受多種基因、蛋白、受體、激素以及信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)[9]。目前研究細(xì)胞凋亡主要通過以下2條途徑實(shí)現(xiàn)：一條是通過死亡受體激活途徑。在這一途徑中，特異性配體FasL（CD95L）與Fas（CD95）結(jié)合后，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面Fas分子聚集形成三聚體，啟動(dòng)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而降解胞內(nèi)功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，最終使靶細(xì)胞凋亡。另一條途徑是線粒體-細(xì)胞色素C途徑。當(dāng)線粒體受到刺激后（如氧化劑、神經(jīng)酰胺、鈣離子、某些胱天酶、Bax等），可釋放出細(xì)胞色素C，從而活化Apaf-1?；罨腁paf-1可通過與CARD-CARD的相互作用而活化Caspase，從而啟動(dòng)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。

細(xì)胞增殖是由細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)控制和調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖周期分為DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）三個(gè)時(shí)期。惡性腫瘤具有的生物學(xué)特征之一是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變和腫瘤失控性增殖。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin dpendent kinases，CDKs）以及其相應(yīng)的抑制分子細(xì)胞周期激酶抑制劑（cyclin kinase inhibitors，CKIs）共同組成了細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，基因突變、細(xì)胞周期蛋白、激酶的失?；蛘呦鄳?yīng)的抑制分子突變均可使細(xì)跑周期調(diào)控系統(tǒng)失控而引起細(xì)胞惡性增殖而形成腫瘤。因此細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制對(duì)于腫瘤的發(fā)生以及進(jìn)展尤其重要，在腫瘤發(fā)生過程中，許多抑癌基因如p15、p16、p53、BRCA1、Rb以及 p53、BRCA1的下游調(diào)控基因如p21、Gadd45發(fā)生突變而失活[11]，造成細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能缺陷，而引起細(xì)胞失控性增殖。

前列消癥湯是治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌及去勢(shì)抵抗性前列腺癌的有效中藥方劑，在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院泌尿外科臨床應(yīng)用十余年。在“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之”、“久病傷氣”等中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科奠基人劉猷枋教授通過不斷的臨床實(shí)踐，運(yùn)用宏觀辨病和微觀辨證相結(jié)合的思維方式，將轉(zhuǎn)移性前列腺癌的核心病機(jī)概括為“正氣不足、濕毒內(nèi)蘊(yùn)”，采用益氣、解毒、利濕治法組方前列消癥湯。該方由薏苡仁、黃精、黃芪、白花蛇舌草、莪術(shù)、土貝母、豬苓組成。方中薏苡仁其味甘、淡，性微寒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有健脾利濕，舒筋除痹，清熱排膿的功效，為方中之君藥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)其中所含薏苡仁多糖等成分不僅具有抗腫瘤活性，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)，提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力[12]。黃芪與黃精兩藥益氣滋陰，共為臣藥，以助薏苡仁健脾益氣之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪中所含的黃芪多糖不僅能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的增殖，還能夠通過靶向調(diào)控腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子，從而達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[13]。而黃精內(nèi)所含有的黃精多糖則能夠抑制小鼠移植腫瘤Heps和Eac的生長(zhǎng)，具有明確的抗腫瘤作用[14]。白花蛇舌草、土貝母、莪術(shù)、豬苓清熱解毒，破血消積，共為佐藥以祛邪。諸藥合用，共奏健脾益氣、解毒散結(jié)利濕之功，體現(xiàn)了中醫(yī)治療晚期腫瘤的扶正祛邪這一基本中醫(yī)治則。前期研究證實(shí)，前列消癥湯能夠顯著抑制裸鼠前列腺癌移植腫瘤的生長(zhǎng)[15]，抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞及PC-3干細(xì)胞的增殖[16-17]，并能下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt、mTOR和NF-κ B 表達(dá)，上調(diào)PTEN 表達(dá)[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明前列消癥湯能夠誘導(dǎo)前列腺癌DU-145細(xì)胞的早期及晚期凋亡，并隨著劑量的增加，促進(jìn)凋亡的作用似乎存在一定程度的增加。如果細(xì)胞生長(zhǎng)被阻斷在細(xì)胞周期的任何一個(gè)時(shí)期，則腫瘤細(xì)胞增殖過程將被阻礙，因而腫瘤的生長(zhǎng)將被抑制。一種有效治療腫瘤的篩選通常觀察其抑制腫瘤的周期。從上述前列消癥湯對(duì)DU-145細(xì)胞周期影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，前列消癥湯使DU-145細(xì)胞在G0/G1期的腫瘤細(xì)胞百分比下降，使S期腫瘤細(xì)胞百分比上升，G2/M 期腫瘤細(xì)胞百分比不變，說(shuō)明前列消癥湯主要抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞從 S期向G2期轉(zhuǎn)變。