廖立紅，袁文彬，陳勇，梁繼超

·生物技術與方法·

MiR-22重組腺病毒的構建及對HepG2細胞葡萄糖攝取的影響

廖立紅1，袁文彬2，陳勇2，梁繼超2

1 武漢大學中南醫(yī)院 兒科，湖北 武漢 430071 2 湖北大學 中藥生物技術湖北省重點實驗室藥物高通量篩選技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖北 武漢 430062

文中構建了miR-22重組腺病毒Ad-miR-22，分析了其對HepG2細胞胰島素信號通路及葡萄糖攝取的抑制作用。通過PCR方法，擴增了miR-22的前體及側翼序列，酶切后克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中，構建穿梭質粒pAdT-22，經(jīng)PCR及測序鑒定。穿梭質粒經(jīng)Ⅰ線性化后，直接轉化含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細胞BJ5183，產生重組腺病毒質粒Ad-miR-22，最后經(jīng)Ⅰ線性化后轉染包裝細胞系293A。重組腺病毒經(jīng)過3輪擴增后感染HepG2細胞，通過熒光定量PCR檢測miR-22表達水平。通過葡萄糖攝取實驗觀察Ad-miR-22對HepG2細胞葡萄糖攝取的影響。采用Western blotting檢測Ad-miR-22對HepG2細胞SIRT1在蛋白質水平的表達及GSK-3β磷酸化水平的影響。采用熒光定量PCR檢測miR-22對PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表達的影響。結果表明，重組腺病毒Ad-miR-22感染顯著增加HepG2細胞miR-22表達水平。此外，Ad-miR-22顯著抑制胰島素誘導的HepG2葡萄糖攝取，并通過下調GSK-3β磷酸化抑制胰島素信號通路的激活。Ad-miR-22反轉胰島素對糖異生關鍵酶表達的抑制作用，并下調SIRT1基因在蛋白質水平的表達。綜上所述，構建了miR-22的重組腺病毒，發(fā)現(xiàn)其顯著增加糖異生，抑制HepG2細胞葡萄糖攝取，該作用可能與miR-22調節(jié)SIRT1在蛋白質水平的表達有關。

miR-22，重組腺病毒，葡萄糖攝取，糖異生，基因治療，SIRT1

隨著我國生活水平的提高、生活習慣的改變，糖尿病患者有不斷增加的趨勢。其中，2型糖尿病患者占比超過了90%。2型糖尿病的發(fā)病機制非常復雜，至今尚未完全研究清楚。過度激活的肝糖異生是2型糖尿病的重要發(fā)病機制之一[1]。

SIRT1作為一個重要的去乙?；?，在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。研究表明，SIRT1可以直接去乙?；疨GC-1α[2]，激活其轉錄共激活子的活性，促進其下游靶基因的表達，而PGC-1α可以在體外及體內強烈激活糖異生關鍵酶PEPCK及G6Pase等的表達[3]。SIRT1的激活劑白藜蘆醇可以通過激活SIRT1的去乙?；富钚?，調節(jié)FOXO1的核轉位，從而增加肝糖異生及葡萄糖輸出[4]。然而，有研究表明，白藜蘆醇可以增加肝胰島素敏感性，降低肝糖異生并促進葡萄糖動態(tài)平衡[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以去乙?；疌RTC2，促進其泛素介導的蛋白質降解，從而抑制肝糖異生基因的表達[6]?？梢?，SIRT1對肝糖異生及2型糖尿病的調節(jié)有雙重作用。

microRNA是一類18–25個核苷酸的微小非蛋白質編碼RNA，研究表明，其在多種疾病包括2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要調節(jié)作用[7-14]。miR-22通過抑制PPARα表達促進心衰及心肌肥大，表明其在心肌能量代謝調控方面有重要調節(jié)作用[15]。miR-22直接靶向AKT通路抑制因子PTEN，進而影響FOXO1核定位，可能對FOXO1下游靶基因表達有影響。有趣的是，AKT的失活會降低miR-22啟動子的活性，這樣miR-22與PTEN和AKT之間可能形成一種反饋調節(jié)機制[16]。在正常飲食條件下，miR-22基因敲除小鼠表現(xiàn)出正常的葡萄糖耐受與胰島素耐受，但是，在高脂飲食條件下，miR-22基因敲除小鼠體重和血脂水平均低于正常小鼠[17]。以上研究顯示，miR-22可能在葡萄糖代謝方面，特別是肝葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡調節(jié)方面發(fā)揮了重要作用。本研究構建了miR-22過表達重組腺病毒，發(fā)現(xiàn)miR-22能抑制SIRT1激活，并抑制HepG2細胞葡萄糖 攝取。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

限制性內切酶Ⅰ及Ⅰ購于NEB公司。λ DNA/dⅢ及DL2000分子量標準購于TaKaRa公司。Lipofectamine 2000轉染試劑及TRizol試劑購于Invitrogen公司。凝膠回收試劑盒購于AXYGEN公司。熒光定量PCR試劑盒購于TOYOBO公司。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購于碧云天公司。蛋白酶及磷酸酶抑制劑購于Roche公司。抗人SIRT1單克隆抗體購于Cell Signaling Technology公司?？谷甩?actin、p-GSK3β及T-GSK3β多克隆抗體購于萬類生物公司。miRNA提取試劑盒購于Ambion。質粒大量提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

引物設計：擴增miR-22前體及側翼序列、 熒光定量PCR的引物見表1 (小寫字母為酶切 位點)。

表1 本研究所用引物

1.2 質粒、菌株及細胞

穿梭載體pAdTrack-CMV來源于Invitrogen公司，由本實驗室保存。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α由本實驗室制備并保存，BJ5183感受態(tài)由本實驗室制備并保存。293A及HepG2細胞來源于武漢大學細胞中心，由本實驗室保存。

1.3 穿梭質粒及重組腺病毒質粒的構建

經(jīng)PCR擴增的miR-22片段首先連接至pGEM-T easy載體，測序正確后，再用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后亞克隆至pAdTrack-CMV載體上，構建重組穿梭質粒pAdT-22。重組質粒pAdT-22用Ⅰ酶切線性化，回收純化后電轉化含有pAdEasy-1質粒的BJ5183感受態(tài)細胞，卡那霉素篩選平板培養(yǎng)18 h左右，挑取6–8個較小的單克隆，小量提取質粒DNA，用Ⅰ酶切篩選陽性克隆，得到重組腺病毒質粒pAd-miR-22。

1.4 重組腺病毒的包裝和擴增

大量提取質粒pAd-miR-22，并純化，取約4 μg質粒用Ⅰ進行酶切線性化，經(jīng)乙醇沉淀回收后，用Lipofectamine 2000轉染293A細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)擴增斑。繼續(xù)培養(yǎng)細胞至約50%的細胞變圓并飄起，離心收集細胞，經(jīng)4次反復凍融裂解細胞，離心收集上清即得第1代重組腺病毒。按照Invitrogen公司說明書，對重組腺病毒進行擴增，第3代擴增的腺病毒可用于細胞實驗，病毒滴度為5×109PFU/mL。

1.5 熒光定量PCR

按照試劑盒說明書提取miRNA，經(jīng)反轉錄后采用Taqman探針法分析miR-22表達水平。細胞總RNA經(jīng)TRIzol提取后反轉錄合成cDNA，采用SYBR法定量分析基因表達水平，結果采用2-ΔΔCt表示。實驗重復3次，取平均值。

1.6 葡萄糖攝取檢測

HepG2細胞接種于6孔板，感染腺病毒24 h后更換無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓3 h，用50 μmol/L 2-NBDG (美國Invitrogen公司) 及100 nmol/L胰島素處理細胞30 min，收集細胞，于485 nm/535 nm激發(fā)/發(fā)射波長測定熒光值。為了校正細胞接種量的差異對結果的影響，葡萄糖攝取結果用總蛋白質進行歸一化處理，即數(shù)據(jù)用熒光強度除以蛋白質濃度來表示。實驗重復3次，取平均值。

1.7 細胞糖原含量檢測

HepG2細胞接種于6孔板，感染相應腺病毒24 h，血清饑餓12 h后100 nmol/L胰島素處理24 h，取105個細胞按照糖原含量檢測試劑盒(北京Solarbio公司)說明書進行糖原含量測定。即離心收集細胞，用試劑盒提供的提取液重懸后超聲(200 W，每次3 s) 30次，之后煮沸20 min，按說明書加入相關試劑和濃硫酸，沸水浴10 min，冷卻后620 nm波長測定吸光值。實驗重復3次，取平均值。

1.8 Western blotting

接種HepG2細胞于6孔板，24 h后感染Ad-GFP或Ad-miR-22。24 h后收集細胞RIPA裂解，或者無血清DMEM處理3 h后用100 nmol/L胰島素處理細胞15 min，之后RIPA裂解細胞。用于裂解細胞的RIPA含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑。經(jīng)BCA法測定蛋白質濃度。加入上樣緩沖液并煮沸10 min后上樣50 μg總蛋白質進行電泳。電泳結束后將蛋白轉印到PVDF膜上，3% BSA封閉后用相應一抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗 4次，HRP標記二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗 6次，加入ECL化學發(fā)光液之后成像分析。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 構建重組穿梭質粒pAdT-22

設計引物，PCR擴增miR-21片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，如圖1所示，擴增產物長度與預計相同。擴增產物經(jīng)切膠回收后連接到pGEM-T easy載體上，再用Ⅰ和Ⅰ進行酶切，同時pAd-Track-CMV載體用相同的酶進行雙酶切，5 h后凝膠電泳并切膠回收DNA片段。將載體與miR-22片段按照1∶7混合，用T4 DNA連接酶進行連接過夜，轉化DH5α感受態(tài)細胞并涂卡那霉素抗性平板過夜，挑取2–3個單克隆，小量制備質粒，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ雙酶切后凝膠電泳鑒定。如圖2所示，雙酶切2 h后電泳，泳道1和2均出現(xiàn)一條約480 bp的DNA片段，說明可能是重組質粒，泳道3可能是載體自連的產物。將泳道1和2相應陽性克隆進行測序，結果表明PCR擴增產物插入pAd-Track-CMV載體，插入序列無突變，插入方向正確。以上結果證明重組穿梭質粒pAdT-22構建成功，可以用于下一步實驗。

圖1 miR-22基因片段的PCR擴增

圖2 重組穿梭質粒pAdT-22的雙酶切鑒定

2.2 構建重組腺病毒過表達載體

大量制備重組穿梭質粒pAdT-22并進行純化，取3 μg重組質粒用Ⅰ酶切，凝膠電泳分離后進行DNA片段回收。線性化的重組穿梭質粒與含有pAdEasy-1骨架質粒的BJ5183感受態(tài)細胞混合，在2 500 V、200 Ohms、25 μF的條件下進行電穿孔轉化。涂卡那霉素抗性平板培養(yǎng)過夜，挑取6–10個較小的單克隆，小量制備質粒后用Ⅰ進行酶切并凝膠電泳鑒定。如圖3所示，酶切產生3.5 kb或4 kb左右的條帶即為陽性克隆，證明重組腺病毒過表達載體構建成功，命名為pAd-miR-22。將pAd-miR-22轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，大量提取質粒并純化。

2.3 重組腺病毒顆粒的產生及大量擴增

取4 μg純化的pAd-miR-22質粒，用Ⅰ進行酶切線性化，乙醇沉淀回收DNA后用Lipofectamine 2000轉染對數(shù)生長期的293A細胞，48–72 h左右可以觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達。5–7 d后觀察到所有細胞均有GFP的表達，并逐漸出現(xiàn)擴增斑。如圖4所示，大約2周左右，50%的細胞變圓并漂起，收集細胞，液氮/ 37 ℃水浴反復凍融4次，離心收集上清，即重組miR-22過表達腺病毒。取少量含有重組腺病毒的細胞培養(yǎng)基上清，感染對數(shù)生長期的新鮮293A細胞，對腺病毒進行擴增。

圖3 重組腺病毒載體的PacⅠ酶切鑒定

圖4 重組腺病毒在293A細胞中的包裝及綠色熒光蛋白的表達

2.4 miR-22在HepG2細胞中的表達分析

培養(yǎng)HepG2細胞，分別感染Ad-GFP和Ad-miR-22腺病毒，24 h和48 h后分析miR-22表達水平。如圖5所示，與對照組相比，感染Ad-miR-22后，細胞內miR-22表達水平顯著升高(<0.05)。

2.5 miR-22對肝細胞糖異生及葡萄糖攝取的抑制

進一步分析了過表達miR-22對肝細胞糖異生及葡萄糖攝取的影響，HepG2細胞分別感染Ad-GFP和Ad-miR-22后熒光定量PCR分析糖異生關鍵基因表達，或血清饑餓3 h對細胞同步化，胰島素及2-NBDG處理細胞30 min，熒光酶標儀檢測葡萄糖攝取。如圖6A所示，Ad-miR-22處理顯著誘導糖異生關鍵酶PEPCK和G6Pase基因mRNA表達。而過表達miR-22顯著抑制基礎及胰島素刺激的HepG2細胞葡萄糖攝取(圖6B)。此外，我們研究了過表達miR-22對正常肝細胞L02葡萄糖攝取的影響，得到了類似的結果，過表達miR-22顯著抑制了L02細胞葡萄糖的攝取(圖6C)。以上研究結果表明miR-22可能抑制肝細胞葡萄糖代謝。

圖5 熒光定量PCR分析miR-22表達水平

2.6 miR-22對肝細胞糖原合成的抑制

肝細胞在調節(jié)機體葡萄糖代謝過程中發(fā)揮了重要作用，進食后胰島素會增加肝細胞糖原合成，從而維持正常血糖水平。本研究最后分析了過表達miR-22對肝細胞糖原合成的影響。如圖7A所示，過表達miR-22對基礎糖原合成沒有顯著影響，但對胰島素刺激的糖原合成有顯著抑制作用。同樣，我們在正常肝細胞L02中得到類似的結果，miR-22過表達顯著抑制胰島素誘導的糖原合成(圖7B)。

2.7 miR-22對GSK-3β磷酸化及SIRT1蛋白質表達的抑制

如圖8所示，與對照組相比較，腺病毒介導的過表達miR-22顯著抑制胰島素刺激的GSK3β磷酸化，并降低SIRT1蛋白表達水平。

圖6 過表達miR-22抑制糖異生及葡萄糖吸收

圖7 過表達miR-22抑制胰島素誘導的糖原合成

圖8 過表達miR-22抑制GSK3β磷酸化及SIRT1蛋白表達

3 討論

在生理條件下，機體糖代謝的調節(jié)主要依靠肝臟、脂肪和肌肉三大代謝組織來完成[18]。進食后，胰島素分泌增加，促進肌肉和肝臟攝取葡萄糖，并轉化為肌糖原和肝糖原進行儲存[19]。同時，脂肪細胞在胰島素的刺激下葡萄糖攝取增加，并最終轉變?yōu)橹具M行存儲[20]。機體對葡萄糖的轉運主要通過細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白(GLUT1–4) 來完成[21]，其中肝臟主要由GLUT2負責葡萄糖的轉運。對葡萄糖轉運蛋白結構的解析以及對其表達調控的研究一直是糖代謝研究的熱點領域[22-26]，然而由于人GLUT2屬于膜蛋白，結構特殊，解析其三維結構極具挑戰(zhàn)性，導致人類對其三維結構知之甚少。由于2型糖尿病發(fā)病機制非常復雜，目前尚未完全研究清楚。已經(jīng)上市的治療藥物較多，但基本難以完全治愈。2型糖尿病在我國的發(fā)病率正呈逐年增長趨勢，嚴重影響我國居民健康，進一步揭示其發(fā)病機制，尋找新的治療靶點將為抗2型糖尿病新藥研發(fā)提供新的思路。

microRNAs是一類小分子量非蛋白質編碼RNA，研究表明其在糖代謝過程中扮演了重要角色。最近有研究顯示，miR-22在db/db糖尿病模型小鼠肝臟表達水平顯著升高，提示miR-22可能參與了肝細胞葡萄糖代謝，并可能與肝細胞胰島素抵抗密切相關[27]。目前用于基因投遞的方式主要分為脂質體、陽離子聚合物等介導的轉染和病毒介導的轉染，前者轉染效率低且不穩(wěn)定，對細胞損傷較大，血清對轉染效率影響較大。而病毒載體如腺病毒介導的轉染不僅效率高，而且對細胞無損傷，血清對轉染效率影響較小，此外還可以在動物水平進行高效轉染。因此，我們設計構建了新的miR-22腺病毒表達載體，希望通過腺病毒載體在肝細胞過表達miR-22，分析其對肝細胞糖異生、葡萄糖攝取及糖原合成的影響，揭示miR-22調節(jié)肝糖代謝的分子機制。同時，為動物水平研究miR-22的功能提供了可靠的載體系統(tǒng)。在載體構建過程中，如圖2所示，泳道1和2對應的小分子量目標條帶較弱，主要是因為載體的分子量大約為9 000 bp，而插入的小分子量目標條帶只有480 bp，導致上下兩條帶的亮度差異較大。

本研究結果表明，過表達miR-22顯著抑制基礎及胰島素刺激的HepG2細胞葡萄糖攝取，但miR-22是否影響了葡萄糖轉運蛋白的表達或膜定位還需要進一步的研究。之前的研究顯示，miR-22能夠增加肝細胞糖異生，進而影響其葡萄糖輸出，而過度激活的肝糖異生與2型糖尿病密切相關，這些研究結果與我們的數(shù)據(jù)相一致。

最近的研究顯示，miR-22參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[28-31]，體內和體外研究均表明miR-22能調節(jié)這些腫瘤細胞的增殖與凋亡，但機制尚未研究清楚。腫瘤細胞與正常細胞的區(qū)別在于，其增殖失控，需要更多的糖來維持高代謝活性，miR-22可以調節(jié)細胞葡萄糖攝取，是否與其在腫瘤代謝調控中的重要角色有關，還需要進一步的探索。

綜上所述，我們構建了miR-22的過表達腺病毒，并發(fā)現(xiàn)上調miR-22的表達水平促進糖異生基因的表達、抑制HepG2細胞葡萄糖攝取及糖原合成，該作用可能與其調節(jié)SIRT1蛋白表達水平有關。

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Effect of recombinant adenovirus Ad-mir-22 on glucose uptake in HepG2 cells

Lihong Liao1, Wenbin Yuan2, Yong Chen2, and Jichao Liang2

1Department of Pediatrics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 2 Hubei Province Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine, National and Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China

The recombinant adenoviruses expressing miR-22 (Ad-miR-22) was constructed and the effect of Ad-miR-22 on insulin signal pathway and glucose uptake in HepG2 cells was analyzed. MiR-22 gene was amplified by PCR from human hepatocytes and cloned into the pAdTrack-CMV vector to generate the shuttle plasmid pAdT-22. The positive colonies were confirmed by PCR and sequencing. The resultant shuttle plasmid was linearized withI, followed by co-transformation into competent BJ5183 cells containing an adenoviral backbone plasmid (pAdEasy-1) to create the recombinant plasmid pAd-miR-22. After digested withI, the linearized pAd-miR-22 was transfected into 293A packaging cell line to generate recombinant adenoviruses Ad-miR-22. HepG2 cells were infected with Ad-miR-22 or control Ad-GFP (adenoviruses expressing green fluorescent protein), and then the miR-22 expression levels were analyzed by qPCR. The result shows that adenovirus-mediated overexpression of miR-22 significantly decreased insulin-induced glucose uptake in HepG2 cells. Moreover, overexpression of miR-22 markedly decreased insulin-induced phosphorylation of GSK-3β. miR-22 also increased the mRNA levels of gluconeogenic genes in HepG2 cells. Furthermore, Western blotting results indicate that the protein expression of SIRT1 decreased in Ad-miR-22 infected HepG2 cells as compared with Ad-GFP infected HepG2 cells. In summary, overexpressing of miR-22 significantly increased gluconeogenesis while decreased glucose uptake in HepG2 cells. The effect of miR-22 on glucose metabolism may be mediated by SIRT1.

miR-22, recombinant adenoviruses, glucose uptake, gluconeogenesis, gene therapy, SIRT1

August 2, 2019;

December 16, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81400791, 81300555), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2042018kf0082).

Jichao Liang. Tel/Fax: +86-27-88663882; E-mail: liang529114@163.com

國家自然科學基金 (Nos. 81400791，81300555)，中央高校基本科研業(yè)務費專項資金 (No. 2042018kf0082) 資助。

10.13345/j.cjb.190346

廖立紅, 袁文彬, 陳勇, 等. MiR-22重組腺病毒的構建及對HepG2細胞葡萄糖攝取的影響. 生物工程學報, 2020, 36(4): 763–771.

Liao LH, Yuan WB, Chen Y, et al. Effect of recombinant adenovirus Ad-mir-22 on glucose uptake in HepG2 cells. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 763–771.

(本文責編 郝麗芳)