陳毓，許諾，胡振林

·綜 述·

小干擾RNA透皮遞送策略研究進(jìn)展

陳毓1，許諾1，胡振林2

1 溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035 2 溫州大學(xué) 生命科學(xué)研究院，浙江 溫州 325035

小干擾 RNA (Small interfering RNA，siRNA) 已被用于各種皮膚病的治療。然而，由于siRNA具有電負(fù)性、極性強(qiáng)、易被核酸酶降解以及難以突破皮膚表皮屏障等缺陷，使其應(yīng)用受限。因此，安全高效的siRNA遞送載體是siRNA有效治療皮膚病的前提。近年來，隨著對(duì)siRNA研究的不斷深入，基于脂質(zhì)、聚合物、肽和納米顆粒的遞送系統(tǒng)的開發(fā)取得了很大進(jìn)展，一些新的siRNA透皮遞送載體應(yīng)運(yùn)而生，如類脂質(zhì)體、樹枝狀聚合物、細(xì)胞穿透肽、球形核酸納米顆粒等等。文中將重點(diǎn)介紹近年來siRNA透皮遞送載體的最新研究進(jìn)展。

RNA干擾，小干擾RNA，遞送載體，皮膚病，脂質(zhì)體，聚合物，納米顆粒

RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 是一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，可在真核細(xì)胞中引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[1]。siRNA是RNAi的有力工具之一，已應(yīng)用于多種疾病治療。皮膚是siRNA最易到達(dá)的器官，siRNA療法尤其適用于皮膚疾病的治療，很多皮膚病，如銀屑病、色素障礙性皮膚病、雄激素源性脫發(fā)等，早已開展了siRNA治療的臨床試驗(yàn)[2]。但siRNA很難突破皮膚屏障，到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮干擾效應(yīng)。因此，開發(fā)透皮遞送載體是當(dāng)前siRNA應(yīng)用于皮膚病治療的熱點(diǎn)。本文將對(duì)siRNA透皮遞送最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，為設(shè)計(jì)安全高效的siRNA透皮遞送載體、實(shí)現(xiàn)皮膚疾病的高效治療提供參考。

1 siRNA透皮遞送需要克服的障礙

siRNA透皮遞送的障礙主要有細(xì)胞外屏障和細(xì)胞內(nèi)屏障。細(xì)胞外屏障主要來自皮膚角質(zhì)層的阻礙。皮膚由表皮、真皮、皮下組織以及皮膚附屬器官構(gòu)成，提供了抵御有害外來物入侵的屏障。表皮層的最外層角質(zhì)層由終末分化的無核角化細(xì)胞通過橋粒緊密連接構(gòu)成10–20 μm厚的薄層，細(xì)胞內(nèi)含大量角蛋白絲，細(xì)胞間由神經(jīng)酰胺、脂肪酸和膽固醇組成的脂質(zhì)基質(zhì)粘合在一起，形成了所謂的“磚墻結(jié)構(gòu)”[3]。活性物質(zhì)經(jīng)皮滲透主要有跨細(xì)胞、細(xì)胞間和皮膚附屬器3種途徑，而角質(zhì)層的這種結(jié)構(gòu)只允許小分子量 (<500 Da) 的親脂性分子滲透，因而角質(zhì)層被認(rèn)為是皮膚的主要物理屏障，阻礙了外來物的進(jìn)入[4]。而siRNA的極性強(qiáng)且分子量在13 kDa左右，難以穿過皮膚屏障，因而角質(zhì)層成為了siRNA透皮遞送首要克服的障礙[2]。細(xì)胞內(nèi)的障礙是從細(xì)胞膜的滲透一直至siRNA對(duì)靶mRNA的作用，siRNA帶負(fù)電荷且分子量高，很難通過細(xì)胞膜，即使siRNA穿過細(xì)胞膜，裸siRNA也易被溶酶體或者核酸酶降解而失活[5]。

2 siRNA透皮遞送載體

理想的siRNA透皮遞送載體應(yīng)能克服 siRNA的理化性質(zhì)，滿足皮膚滲透條件，以及保護(hù)siRNA免受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的作用。近年來，開發(fā)了不少siRNA的皮膚遞送載體，包括脂質(zhì)體、樹枝狀分子、細(xì)胞滲透肽、納米顆粒等等，這些載體的優(yōu)點(diǎn)包括高遞送效率、高生物相容性、低免疫原性以及靶向性等[6]。

2.1 基于脂質(zhì)的siRNA遞送系統(tǒng)

脂質(zhì)載體是運(yùn)用最廣泛的藥物遞送系統(tǒng)，也是應(yīng)用最早的透皮載體。脂質(zhì)系統(tǒng)遞送效率受粒徑、電荷、脂質(zhì)比或組成成分等因素的影響，其大小在20 nm至0.5 μm不等，主要以包裹形式攜帶siRNA向皮膚各層遞送?？偟膩碚f，這類脂質(zhì)系統(tǒng)由于與皮膚脂質(zhì)成分相近而具有較好的生物相容性、低免疫原性、制備簡(jiǎn)單以及開發(fā)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在siRNA的透皮遞送載體設(shè)計(jì)中較受歡迎。

2.1.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體 (Liposomes) 是由磷脂和其他類脂構(gòu)成脂質(zhì)雙分子層包圍親水核心的閉合囊球 (圖1)。脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA遞送系統(tǒng)將siRNA包裹到水性囊泡中或?qū)⒅|(zhì)體與siRNA相連，通過脂質(zhì)體的變形性，將攜帶著的siRNA從角質(zhì)層細(xì)胞間擠過。然而，傳統(tǒng)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)成分與角質(zhì)層、細(xì)胞膜的脂基成分相似，雖提高了其生物相容性，但在透皮過程中容易發(fā)生聚集而無法深入皮膚深層，同時(shí)結(jié)構(gòu)中的磷脂易氧化而影響穩(wěn)定性，因而傳統(tǒng)脂質(zhì)體遞送siRNA在皮膚應(yīng)用研究中并不多見[7-8]。為改善脂質(zhì)體攜帶siRNA向靶點(diǎn)的透皮遞送，開始對(duì)傳統(tǒng)脂質(zhì)體進(jìn)行優(yōu)化，其中之一就是開發(fā)了以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為主的siRNA脂基遞送系統(tǒng)，比如1,2-二十八烯基-3-三甲胺-丙烷 (DOTMA)、1,2-二烯基-3-三甲胺-丙烷 (DOTAP)等[9]?；陉?yáng)離子脂質(zhì)載體DOTAP為主的脂蛋白復(fù)合物遞送系統(tǒng)用于透皮遞送針對(duì)Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (Keap1) 的siRNA，有效抑制了NF-E2相關(guān)因子2 (Nrf-2) 的表達(dá)，改善了糖尿病小鼠模型中的傷口閉合[10]。

圖1 用于siRNA遞送的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)

2.1.2 類脂質(zhì)體

類脂質(zhì)體 (Niosomes) 是由非離子表面活性劑自組裝成的單層或雙層結(jié)構(gòu)[11]。與脂質(zhì)體相比，類脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性和包封效率、更好的靈活性和強(qiáng)滲透性以及較低的生產(chǎn)成本。類脂質(zhì)體能可逆降低角質(zhì)層的阻隔性，使活性成分更快通過表皮層，很多市售皮膚護(hù)理產(chǎn)品都運(yùn)用類脂質(zhì)體來遞送活性成分。然而類脂質(zhì)體遞送效率受多種因素影響，如表面活性劑的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)、包封藥物的性質(zhì)、膜組成形狀等。目前以類脂質(zhì)體為原型衍生出了核-殼結(jié)構(gòu)的納米球概念，大小在10 nm至200 nm之間，能更有效地向皮膚深層遞送活性成分[12]。局部應(yīng)用這些載體遞送siRNA，可能比脂質(zhì)體顯示更強(qiáng)的基因沉默能力。

2.1.3 可變形囊泡

可變形囊泡 (Ultradeformable vesicles，UDV)，又稱柔性納米脂質(zhì)體，因具有高度變形性和水化梯度驅(qū)動(dòng)力，更易通過皮膚上的微孔道，將負(fù)載藥物遞送到表皮和真皮層中，克服了傳統(tǒng)脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性以及皮膚滲透性差等缺點(diǎn)，有望成為新一代的藥物靶向載體[13]。目前關(guān)注較高的UDV主要是傳遞體 (Transfersomes)、醇質(zhì)體 (Ethosomes) 和醇傳遞體(Transethosomes) 3種，其最大區(qū)別在于摻入了不同極性的活性物質(zhì)，因此對(duì)皮膚的滲透性也有所不同[14]。

傳遞體是第一代UDV，主要由磷脂和邊緣活化劑 (EAs) 如膽酸鈉 (NaCho)、脫氧膽酸鈉、Span、Tween和甘草酸二鉀組成[15]。EAs/磷脂比是影響其在皮膚層滲透深度和遞送效率的關(guān)鍵因素，EAs的摻入增加了角質(zhì)層的水合作用，增強(qiáng)了皮膚的親和力，同時(shí)EAs能使囊泡輕易改變形狀以應(yīng)對(duì)外來機(jī)械壓力，使之能擠過直徑只有囊泡十分之一的通道[16-17]。Dorrani等[18]在黑色素瘤治療研究中發(fā)現(xiàn)DOTAP/NaChol為6∶1的傳遞體可滲透皮膚層且將BRAF-siRNA均勻地沉積在真皮層，調(diào)整配制比為8∶1時(shí)，其可有效地穿透角質(zhì)層并沉積于下表皮/上真皮，且此種配比下siRNA的遞送速率最高；然而配制比為10∶1的傳遞體克服角質(zhì)層屏障后只能沉積在上表皮中。

醇質(zhì)體是主要由磷脂、20%–45%低級(jí)醇和水組成的囊泡[19]。因含高劑量乙醇體，形成了高彈性囊泡膜，具有柔軟可塑、強(qiáng)變形性的特點(diǎn)，同時(shí)乙醇體可以嵌入到皮膚脂質(zhì)分子層中，破壞并溶解角質(zhì)層的脂質(zhì)，改善了諸如siRNA類高親水性分子在封閉和非封閉條件下向皮膚深層的遞送[20]。Chen等[21]設(shè)計(jì)了一種SPACE穿透肽修飾的醇脂質(zhì)體，該組合系統(tǒng)促進(jìn)了GAPDH-siRNA在豬皮膚中的滲透和積累。

醇傳遞體是2012年Song等開發(fā)出的一種新型柔性脂質(zhì)載體，其結(jié)合了醇質(zhì)體和傳遞體的優(yōu)點(diǎn)，除基本的脂質(zhì)成分外，同時(shí)也具有高含量的乙醇 (高達(dá)30%) 和邊緣活化劑，致使其在皮膚的滲透和駐留能力均比醇質(zhì)體和傳遞體強(qiáng)，同時(shí)，醇傳遞體能穩(wěn)定包封siRNA長(zhǎng)達(dá)4周[13,22-23]。在皮膚人源化小鼠牛皮癬模型中，包封于醇傳遞體中的DEFB4-siRNA被準(zhǔn)確地遞送至表皮抑制靶基因的表達(dá)，改善了小鼠背部銀屑病樣特征[24]。

伴隨著脂質(zhì)系統(tǒng)在透皮靶向遞送siRNA設(shè)計(jì)上的不斷優(yōu)化，其可能成為用于治療諸如牛皮癬等皮膚疾病較有前途的治療工具。但是受尺寸、電荷等影響，脂質(zhì)系統(tǒng)還需改進(jìn)低封裝效率的問題。

2.2 基于聚合物的siRNA遞送系統(tǒng)

基于聚合物的遞送載體具有生物相容性和可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，在siRNA透皮遞送載體研究中越來越受到關(guān)注，其不僅解決了siRNA低攜帶率的難題，同時(shí)也表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染率。大部分聚合物通常含高密度正電荷，與帶負(fù)電荷的siRNA通過靜電結(jié)合作用，自發(fā)形成緊湊的siRNA-聚合物復(fù)合物，可大大降低siRNA表面的負(fù)電荷，進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性，同時(shí)克服了裸siRNA難以輕易穿過細(xì)胞生物膜的障礙。此外，這些高電荷密度的陽(yáng)離子聚合物通常具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，這有利于協(xié)助寡核苷酸從內(nèi)體逃逸，保護(hù)siRNA免于降解，從而能提高siRNA轉(zhuǎn)染效率[25]。因考慮到生物降解性問題，目前基于聚合物的siRNA遞送載體主要向樹突狀大分子等生物可降解聚合物的方向發(fā)展。

2.2.1 聚乙烯亞胺

聚乙烯亞胺 (Polyethyleneimine，PEI) 是研究較多的用于遞送核酸的聚合物載體。PEI的結(jié)構(gòu)內(nèi)含許多氨基基團(tuán)，并呈現(xiàn)高密度正電荷，促使其具有較好的絡(luò)合作用和內(nèi)體/溶酶體途徑所涉及到的pH范圍內(nèi)的pH緩沖能力，保護(hù)核酸免受溶酶體降解，這也是其高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素[26-27]。PEI的獨(dú)特性能使其成為siRNA遞送載體而被廣泛應(yīng)用。然而PEI的一個(gè)顯著缺點(diǎn)就是細(xì)胞毒性問題，PEI以線狀和分支狀兩種形式存在，隨著分子量和分支結(jié)構(gòu)的增加，其轉(zhuǎn)染效率相對(duì)來說不斷提高，但表現(xiàn)出來的細(xì)胞毒性也隨之增加。因此，與分支狀PEI相比，線性或者低分子量的PEI似乎擁有良好的轉(zhuǎn)染效率和低毒性。然而低分子量的PEI供siRNA結(jié)合的位點(diǎn)較少，在酸性環(huán)境下不能維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這就大大限制了PEI作為遞送載體的能力[28-29]。為了克服這一缺點(diǎn)，在不改變其理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)PEI進(jìn)行了各種修飾以優(yōu)化PEI遞送載體。比如在皮膚疤痕研究過程中[30]分子量25 kDa的PEI處理的細(xì)胞，其活力僅不到30%，而PEI經(jīng)山梨醇修飾后 (PSPEI)，顯著降低了細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力提高至80%；在傷口處結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 (CTGF) 高表達(dá)，向傷口處遞送CTGF-siRNA以沉默CTGF，減少傷口愈合時(shí)疤痕的形成，經(jīng)PSPEI處理的傷口較裸siRNA或25 kD-PEI組提前愈合，且傷口疤痕縮小。此外，經(jīng)硬脂酸修飾的PEI (StA-PEI) 將siRNA遞送至B16黑色素瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了STAT3的高效下調(diào)，而且StA-PEI絡(luò)合siRNA所需要的含量比PEI更少，這表明其潛在的毒性可能更低[31]。

2.2.2 樹突狀聚合物

樹突狀聚合物是具有樹狀結(jié)構(gòu)的納米級(jí)大分子[32](圖2)。與傳統(tǒng)的線性和支鏈聚合物不同，樹突狀聚合物有以下一些優(yōu)點(diǎn)：1) 可控制的大小和親脂性，造就了樹突狀聚合物球形形態(tài)及其通過細(xì)胞膜的能力[33]；2) 具有豐富的末端基團(tuán)可進(jìn)行不同配體的修飾，例如探針、靶向配體等，這些修飾降低了siRNA-樹突狀聚合物在遞送過程中的毒性，提高靶向性[34]；3) 優(yōu)良的柔韌性使其空間位阻較低，利于和siRNA結(jié)合并可形成約70 nm的穩(wěn)定納米粒，協(xié)助siRNA從酸性內(nèi)體環(huán)境中逃逸，從而促進(jìn)siRNA的釋放，達(dá)到基因沉默的效果[35-36]。目前已開發(fā)了在siRNA遞送中均取得良好效果的多種樹狀聚合物，如高負(fù)載能力的氟化樹枝狀聚合物、優(yōu)良生物相容性能的氨基酸官能化樹枝狀聚合、高轉(zhuǎn)染能力的碳硅烷樹枝狀聚合物，除此之外還有聚胺類樹狀聚合物、聚丙烯亞胺類樹狀聚合物、聚賴氨酸類樹狀聚合物等[2]。近年來為進(jìn)一步改善樹枝狀聚合物透皮遞送效率，許多研究團(tuán)隊(duì)開始對(duì)其進(jìn)行重新設(shè)計(jì)或者優(yōu)化。Liu等[37]將兩親性樹枝狀聚合物自組裝成囊泡狀納米結(jié)構(gòu)用于遞送siRNA到多種細(xì)胞類型中，包括原代細(xì)胞和干細(xì)胞，表現(xiàn)出了高遞送效率和成功的基因沉默。在糖尿病大鼠皮膚愈合實(shí)驗(yàn)[38]中環(huán)糊精修飾的聚酰胺-胺 (PAMAM) 陽(yáng)離子星形聚合物成功將MMP9-siRNA遞送至成纖維細(xì)胞中，導(dǎo)致MMP-9表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。經(jīng)C12飽和烷基鏈修飾后的PAMAM在遞送極低劑量的siRNA (10 nmol/L) 時(shí)，其基因沉默效率也能達(dá)到80%[39]。攜帶siRNA-VEGF的可生物還原的氟化肽第二代樹狀聚合物顯示出了優(yōu)異的基因沉默功效，達(dá)到了65%[40]。然而，高效siRNA-樹突狀聚合物遞送載體存在難制備的問題，高代數(shù)的樹突狀分子其結(jié)合siRNA的能力較高，遞送效率雖隨之提高，但同時(shí)空間位阻也相對(duì)增加，導(dǎo)致其制備難度增加，難以大規(guī)模生產(chǎn)，這就限制了其更廣泛的應(yīng)用。

圖2 用于遞送siRNA的樹突狀聚合物

2.2.3 聚乳酸-乙醇酸

聚乳酸-乙醇酸 (Polylactic-co-glycolic acid，PLGA) 是一種具有生物可降解性的安全聚合物，廣泛應(yīng)用于藥物的遞送，包括siRNA遞送。在細(xì)胞水平上，PLGA容易穿透細(xì)胞膜或促進(jìn)siRNA通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在溶酶體降解siRNA之前將其快速釋放到靶位置。然而，有報(bào)道PLGA單獨(dú)與siRNA結(jié)合時(shí)封裝效率、藥物釋放和轉(zhuǎn)染效率都有限，可能受siRNA的陰離子電荷和極性的影響。運(yùn)用PEI修飾的PLGA納米顆粒，提高了對(duì)siRNA的包封效率和釋放度，改善了siRNA在聚合物中的保留，促進(jìn)了siRNA向細(xì)胞質(zhì)的釋放[41]。這些研究表明，PLGA納米顆粒也是siRNA有效皮膚遞送的潛在方法。

雖然siRNA-聚合物載體的研究取得了一些令人欣慰的進(jìn)展，但是毒性問題依然是限制聚合物載體往臨床轉(zhuǎn)化的一大障礙，大部分適用于siRNA的聚合物透皮載體表面攜帶較多的正電荷，雖因此使其保持著較高的轉(zhuǎn)染率，但過多的正電荷同時(shí)會(huì)增加復(fù)合物的細(xì)胞毒性，盡管可以通過表面修飾進(jìn)行毒性的降低，但是安全性問題一直是人們最為關(guān)注的焦點(diǎn)，在聚合物載體進(jìn)入臨床應(yīng)用前必須進(jìn)行安全性和毒性的評(píng)估。

2.3 細(xì)胞穿透肽

細(xì)胞穿透肽 (CPP) 作為一種低毒有效的生物活性分子遞送載體也成為了siRNA透皮遞送的候選治療工具。CPP通常由不超過30個(gè)氨基酸的短序列組成，可分為陽(yáng)離子、兩親性和疏水性三類，通過能量依賴或獨(dú)立機(jī)制經(jīng)組織和細(xì)胞膜，將生物活性大分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，具有極高的穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率[42]。目前已有幾種CPP，如TAT、聚精氨酸、TD-1、SPACE肽等，被證明可增強(qiáng)siRNA在皮膚上的遞送。TAT (HIV-1細(xì)胞穿透肽)[43]是富含精氨酸和賴氨酸的陽(yáng)離子類肽，以能量依賴方式克服皮膚障礙，易位進(jìn)入細(xì)胞。TAT載體攜帶siRNA以納米顆粒的形式向皮膚遞送時(shí)，當(dāng)直徑大于70 nm，TAT-siRNA納米顆?？蓮拿掖┻^，70 nm以下的顆粒則可通過表皮滲透[44]。TD-1 (ACSSSPSKHCG)和SPACE肽通過與皮膚角質(zhì)細(xì)胞中的角蛋白結(jié)合促進(jìn)跨細(xì)胞途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)[45]。CPP以共價(jià)或非共價(jià)形式與遞送物綴合，共價(jià)結(jié)合形式相對(duì)耗時(shí)，對(duì)遞送物的特異性要求較高，相對(duì)來說，非共價(jià)綴合顯得較靈活，帶負(fù)電的siRNA通過靜電相互作用與CPP構(gòu)成非共價(jià)復(fù)合物，這避免了對(duì)siRNA的任何化學(xué)修飾，從而極大地保留了siRNA活性，然而，CPP以非共價(jià)結(jié)合形式穿膜，可能干擾CPP與細(xì)胞膜相互作用的能力[46]。因此，許多研究開始對(duì)CPP進(jìn)行化學(xué)修飾或以多聚體形式與另一種siRNA載體結(jié)合使用以允許其不受阻礙被攝取并促進(jìn)釋放。比如Tat肽 (GRKKRRQRRRCG) 和AT1002 (FCIGRLCG) 的雙肽系統(tǒng)[47-48]來增強(qiáng)siRNA在皮膚中的基因干擾效率。siRNA通過與Tat肽靜電復(fù)合以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)遞送，而AT1002肽作為皮膚細(xì)胞緊密連接的調(diào)節(jié)劑以增強(qiáng)復(fù)合物滲透到表皮和真皮中。運(yùn)用特應(yīng)性皮炎小鼠模型研究siRNA皮內(nèi)滲透[49]，AT1002和硬脂酸 (STR)修飾的CH2R4H2C肽作為siRNA的遞送載體，涂抹皮膚1 h后即可在表皮層5–10 μm檢測(cè)到siRNA強(qiáng)熒光信號(hào)，10 h后，siRNA熒光信號(hào)深入到皮膚深層50 μm處；而未經(jīng)修飾的CH2R4H2C肽或STR-CH2R4H2C肽攜帶siRNA僅停留在表皮層5–10 μm處。此外，很多穿膜肽也運(yùn)用納米技術(shù)來優(yōu)化增強(qiáng)其遞送系統(tǒng)，比如正在進(jìn)行Ⅱa期臨床研究的一種抗纖維化siRNA治療候選藥物STP705，其正是利用多肽納米顆粒 (PNP) 增強(qiáng)遞送系統(tǒng)以及雙重靶向抑制特性直接降低了皮膚傷口纖維化活性和炎癥活性，減少了皮膚增生性瘢痕的形成[50]。

除了CPP的遞送優(yōu)勢(shì)外，另外值得注意的是，大部分初級(jí)CPP的細(xì)胞特異性較低，導(dǎo)致靶向性不高，今后在往臨床研究應(yīng)用時(shí)還需要對(duì)其加以優(yōu)化；此外，能應(yīng)用于siRNA透皮遞送的CPP種類有限，高效安全的CPP還需要進(jìn)一步開發(fā)。

2.4 基于納米顆粒的siRNA遞送系統(tǒng)

基于納米級(jí)顆粒的各種新型藥物遞送載體因具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已在透皮遞送領(lǐng)域中取得了一定的地位[51]：1) 根據(jù)大小、形狀、表面電荷以及平衡親水性-疏水性能調(diào)節(jié)角質(zhì)層流化；2) 納米級(jí)遞送載體與皮膚表面緊密接觸，藥物駐留時(shí)間加長(zhǎng)，同時(shí)具有藥物控釋能力；3) 經(jīng)細(xì)胞特異性配體修飾以提高靶向性；4) 納米載體可經(jīng)毛囊等皮膚附屬器向皮膚深層釋放藥物。基于這些優(yōu)點(diǎn)，納米載體被發(fā)展為皮膚基因治療最具潛力的透皮遞送工具。

2.4.1 脂質(zhì)-聚合物雜化納米顆粒

脂質(zhì)-聚合物雜化納米顆粒 (Lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPN) 結(jié)合了聚合物納米顆粒和脂質(zhì)體的特征，在結(jié)構(gòu)完整性、貯存穩(wěn)定性、聚合物核的控釋能力以及生物相容性和生物利用度方面顯示出了極大的優(yōu)越性，已迅速發(fā)展成為一個(gè)強(qiáng)大的基因遞送載體[52]。LPN53]主要包含3種組分：一是包封藥物的可生物降解的聚合物核心；二是包裹聚合物核心的內(nèi)部脂質(zhì)層，主要功能是賦予聚合物核心生物相容性，同時(shí)起到分子?xùn)艡诘淖饔茫畲笙薅鹊販p少封裝物的泄漏，另外通過限制水向內(nèi)擴(kuò)散來減緩聚合物的降解，從而實(shí)現(xiàn)封裝物的持續(xù)釋放；三是外部脂質(zhì)PEG層，用于穩(wěn)定載體，此外脂質(zhì)的嵌入也增加了其在皮膚層的滲透能力。Shi等[54]開發(fā)了PLGA脂質(zhì)雜化納米顆粒，與PLGA和PLGA-PEG相比，雜化納米顆粒siRNA包封率高達(dá)78%–82%，而PLGA和PLGA-PEG僅包封所需siRNA的4%–8%。Desai 等[55]基于此設(shè)計(jì)了一種新型環(huán)狀陽(yáng)離子頭脂質(zhì)-聚合物雜合納米載體 (CyLiPns)，有效地將TNFα- siRNA和辣椒素 (Cap) 遞送至真皮層360 μm處，在治療慢性皮膚炎性疾病方面顯示出協(xié)同作用。

2.4.2 球形核酸納米顆粒

球形核酸納米顆粒 (Spherical nucleic acid nanoparticle conjugates，SNA-NCs) 是一種以球形納米顆粒為核心，高度定向的寡核苷酸致密地附著在納米顆粒表面，以此形成球狀結(jié)構(gòu)的核酸遞送載體，尺寸在5 nm至400 nm之間[56](圖3)。構(gòu)成SNA-NCs核心結(jié)構(gòu)的材料，包括各種各樣的無機(jī)粒子 (金、銀、鉑、二氧化硅等)、有機(jī)材料 (脂質(zhì)體、聚合物等) 或者混合結(jié)構(gòu) (金屬-有機(jī)骨架) 等[57]，這些納米顆粒綴合物本質(zhì)上就是惰性材料，穩(wěn)定性高，具有強(qiáng)抗菌性，既不需要陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染材料也不需要額外的修飾來驅(qū)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，像L’Oreal和L’Core Paris等化妝品巨頭公司正在使用金納米粒子制造更有效的乳霜和乳液。迄今為止，SNA-NC已經(jīng)在超過50種細(xì)胞系、組織和器官中驗(yàn)證了其高效的穿透力、靶向性、快速攝取和低免疫原性等性能。為了證明siRNA-SNA能穿透皮膚進(jìn)行基因調(diào)節(jié)，Zheng等[58]設(shè)計(jì)了金納米顆粒來遞送siRNA，其幾乎100%穿過角質(zhì)形成細(xì)胞，在皮膚局部施用幾小時(shí)后即可穿過小鼠模型和人類皮膚模擬物中的表皮屏障，遞送效率比商用轉(zhuǎn)染劑高達(dá)100倍之多。糖尿病小鼠創(chuàng)口愈合研究中[59]，局部施用經(jīng)SNA遞送的GM3S-siRNA，12 d內(nèi)可完全治愈糖尿病樣小鼠的傷口，相對(duì)于游離的GM3S-siRNA，其加速了傷口愈合，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)小鼠的肺、腎等其他器官中幾乎檢測(cè)不到SNA的痕跡。在銀屑病治療方面，直徑約12 nm的金納米顆粒被開發(fā)出來遞送siRNA，僅24 h就達(dá)到了90%的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，而且在皮摩爾至納摩爾濃度下即可顯示出持久的皮膚內(nèi)基因敲低能力，同時(shí)未表現(xiàn)出毒性[60]。

圖3 用于遞送siRNA的球形核酸納米顆粒

除重金屬納米顆粒以外，介孔二氧化硅納米顆粒 (MSNP) 也被開發(fā)出來用于核酸的遞送。與金納米顆粒不同，MSNP[61]獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)以及較高的比表面積，表現(xiàn)出了高裝載效率、優(yōu)異的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，同時(shí)也易于合成和修飾。Lio等[62]將靶向TGFβR-1的siRNA裝載到經(jīng)多聚賴氨酸修飾 (PLL) 的MSNPs介孔中，構(gòu)建了MSNPs-PLL復(fù)合物，并在異種移植模型小鼠中將siRNA經(jīng)皮遞送到皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，顯著下調(diào)了TGFβR-1的表達(dá)，并抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)2倍之多。這些結(jié)果均表明了SNA-NCs成為siRNA透皮遞送載體的巨大潛力。

3 總結(jié)與展望

文中總結(jié)了脂質(zhì)、聚合物、穿膜肽以及納米顆粒等載體在siRNA透皮遞送過程中的應(yīng)用及研究進(jìn)展。脂質(zhì)載體因其具備低免疫原性以及高度柔韌性而提高了siRNA的遞送效率；聚合物遞送系統(tǒng)優(yōu)良的生物相容性改善了siRNA的生物可降解性；穿膜肽提高了siRNA的透皮性以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)給予了siRNA高度的靶向性和穩(wěn)定性；這些新型的透皮遞送載體克服了siRNA局部透皮釋放的障礙，給siRNA治療劑的開發(fā)提供了新的方向，給皮膚疾病的治療帶來了新的希望。但是將這些siRNA透皮遞送載體真正轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用又是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)，仍然有一系列的問題需要解決。比如，脂質(zhì)載體有限的包裹空間不足以提供高負(fù)載率而難以在靶部位釋放有效作用劑量；聚合物載體高陽(yáng)離子電荷易對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，因而可能影響周邊正常細(xì)胞功能；穿膜肽攜帶siRNA穿透皮膚進(jìn)入體內(nèi)后容易受核酸酶的降解而導(dǎo)致穩(wěn)定性發(fā)生改變；金納米顆粒在體內(nèi)的重金屬累積以及清除也是一個(gè)令人擔(dān)憂的問題。

為了克服這些挑戰(zhàn)，研究者開始重新優(yōu)化siRNA載體系統(tǒng)，比如設(shè)計(jì)基于脂質(zhì)體的雙藥遞送系統(tǒng)[63]，又或者構(gòu)建復(fù)合納米顆粒，比如LPN[64]等等，均比單一成分的遞送系統(tǒng)發(fā)揮出更高效的皮膚內(nèi)基因沉默效果?；诖耍菊n題組結(jié)合穿膜肽與納米顆粒的特性提出構(gòu)建基于穿膜肽修飾的復(fù)合納米載體的思路，我們期望該載體能顯著提高siRNA的透皮性和轉(zhuǎn)染性，通過介導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將siRNA靶向運(yùn)輸至作用部位，改善siRNA的穩(wěn)定性，提高siRNA的生物利用度。我們認(rèn)為從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，復(fù)合納米載體的siRNA透皮遞送載體將表現(xiàn)出更大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢?huì)是一種潛在高效的siRNA局部透皮給藥系統(tǒng)。

目前，關(guān)于siRNA的透皮遞送系統(tǒng)的開發(fā)研究越來越多，隨著研究的深入，相信在不久的將來，會(huì)有更多新型的siRNA透皮遞送載體被設(shè)計(jì)出來，基于siRNA的RNAi技術(shù)將逐步成熟，其將在皮膚疾病乃至其他疾病治療方面作出巨大貢獻(xiàn)。

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Research progress in transdermal delivery for small interfering RNA

Yu Chen1, Nuo Xu1, and Zhenlin Hu2

1,,325035,,Institute of Life SciencesWenzhou UniversityWenzhouZhejiangChina

Small interfering RNA (siRNA) has been used to treat various skin diseases. However, siRNA is limited in application due to its electronegativity, strong polarity, easy degradation by nuclease and difficulty in breaking through the skin barrier. Therefore, safe and efficient siRNA delivery vector is the premise of effective treatment of skin diseases by siRNA. In recent years, with the deepening of research on siRNA, great progress has been made in the development of delivery systems based on lipids, polymers, peptides and nanoparticles, some new transdermal delivery vectors of siRNA have emerged, such as liposomes, dendrimers, cell penetrating peptides, and spherical nucleic acid nanoparticles. This review will focus on the recent advance in siRNA transdermal delivery vectors.

RNA interference,small interfering RNA, delivery vector, skin diseases, lipidosome, polymers, nanoparticles

June12, 2019;

November11, 2019

Zhenlin Hu. Tel: +86-577-86591693；E-mail: zhenlinhu@hotmail.com

10.13345/j.cjb.190246

2019-11-21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191120.1611.001.html

陳毓，許諾，胡振林.小干擾RNA透皮遞送策略研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 622–631.

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(本文責(zé)編 郝麗芳)