吳漢華 ，張元杰，劉科宇，董 良，張 紅

(1.遵義醫(yī)科大學 貴州省麻醉與器官保護重點實驗室暨貴州省普通高等學校腦科學特色重點實驗室， 貴州 遵義 563099；2.遵義市第四人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099)

隨著心臟手術(shù)及體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)技術(shù)的提高，心臟病人術(shù)后并發(fā)癥正逐漸減少，但急性肺損傷(Acute lung injury ，ALI)仍然是 CPB 術(shù)后的主要并發(fā)癥之一[1]，重者可發(fā)展為急性呼吸道窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，死亡率高達50%[2]。CPB肺損傷的具體機制并不清楚，大多數(shù)學者認為主要原因是缺血再灌注損傷和全身炎癥反應(yīng)綜合征。

膜聯(lián)蛋白A1(AnxA1)是膜聯(lián)蛋白超家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，參與多種細胞生物學功能，包括細胞增殖分化、凋亡和抗炎癥作用；其廣泛分布在成年哺乳動物體內(nèi)[3]。AnxA1活化后被轉(zhuǎn)運到細胞表面，與甲?；氖荏w(Formylpeptide receptor，F(xiàn)PR)特異性結(jié)合發(fā)揮作用，通過促進炎癥細胞的凋亡，下調(diào)白細胞在損傷或感染部位的聚集調(diào)節(jié)炎癥的消退[4]。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，AnxA1基因敲除小鼠因為該蛋白的缺失導(dǎo)致比野生型小鼠更嚴重的肺部炎癥和纖維化[5]。

本實驗擬對野生型及AnxA1基因敲除型大鼠建立CPB肺損傷模型，觀察AnxA1在CPB肺損傷中的作用，為臨床尋找有效的CPB肺保護措施提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 全身AnxA1-/-大鼠(KO大鼠)和SD野生型大鼠(WT大鼠)各12只，12～16周齡，體重350～450 g，KO大鼠由上海和元生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2018-0003；SD野生型大鼠由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2019-0015。

1.2 試劑 兔抗大鼠AnxA1單克隆抗體(英國Abcam)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(武漢三鷹)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 按隨機數(shù)字表法分組：①WT大鼠假手術(shù)組(WT-Sham)；②WT大鼠肺損傷組(WT-IR組)；③KO大鼠假手術(shù)組(KO-Sham組)；④KO大鼠肺損傷組(K0-IR組)，每組6只。

1.3.2 動物模型的建立 所有大鼠術(shù)前禁食12～16 h，自由飲水。根據(jù)本課題組設(shè)計建立大鼠CPB肺損傷模型[6]，用1%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上，喉鏡明視下確認氣管插管成功連接呼吸機，設(shè)定潮氣量12 mL/kg，呼吸頻率60次/min，吸呼比=1∶2.5，吸入氧濃度：99%。行尾靜脈穿刺置管用于給藥，分離兩側(cè)股靜脈及右側(cè)頸動脈并穿刺置管，分離一側(cè)股動脈連接生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測大鼠生命體征。準備并安裝好儲血室(20 mL注射器)、蠕動泵、硅膠泵管(直徑1.6 mm)、大鼠膜肺及動、靜脈管路。20 mL注射器抽取羥乙基淀粉9 mL，鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液1 mL，5%碳酸氫鈉1 mL，甘露醇1 mL預(yù)充CPB管道及實驗用膜式氧合器，排出CPB管道中的氣泡。尾靜脈注射肝素5 mg/kg，連接CPB管道，待激活全血凝固時間(ACT)≥480 s后，將雙側(cè)股靜脈血液引流至儲血室中，經(jīng)膜肺過濾氧合后，經(jīng)右側(cè)頸總動脈輸注回流轉(zhuǎn)機；10 min后開胸用無創(chuàng)血管鉗夾閉左側(cè)肺門，轉(zhuǎn)機45 min后，開放左側(cè)肺門恢復(fù)雙肺通氣，繼續(xù)轉(zhuǎn)機30 min后經(jīng)尾靜脈注射魚精蛋白中和多余肝素后停止轉(zhuǎn)機；再持續(xù)機械通氣90 min后實驗結(jié)束。CPB期間維持肛溫在32～34 ℃，平均動脈壓在50～80 mmHg，灌注流量在40 mL/(kg·min)。術(shù)中密切關(guān)注動脈血氣分析結(jié)果維持大鼠內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；采用戊巴比妥鈉維持麻醉深度，芬太尼保證術(shù)中鎮(zhèn)痛，維庫溴銨維持肌松，必要時應(yīng)用血管活性藥物維持大鼠生命體征。

1.3.3 標本采集 分別在體外循環(huán)前(T1)、開放肺門后(T2)和實驗結(jié)束時(T3)取動脈血行血氣分析，計算大鼠氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)，術(shù)中記錄大鼠生命體征。各組大鼠在實驗后處死，取左肺組織，一部分行電鏡和光鏡觀察肺組織損傷程度，一部分行冰凍切片TUNEL法檢測中性粒細胞的凋亡率，另外提取組織蛋白行免疫印跡檢測。

1.3.4 肺組織病理檢查 左肺組織經(jīng)石蠟包埋處理，切成3～5 μm薄片，50%乙醇和正丁醇分別脫水2次，二甲苯脫蠟3次，蘇木精-伊紅(HE)染色后封片。每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野(×100)，采用Cheng C等[7]標準進行評分。按照肺泡及肺泡間質(zhì)有無水腫液和紅細胞滲出的面積及炎性細胞浸潤程度半定量評估肺損傷的程度，評分標準為：0分(無)，1分(<25%，間質(zhì)少量中性粒細胞)，2分(25%～50%，間質(zhì)及部分肺泡腔內(nèi)有較多中性粒細胞)，3分(50%～75%，間質(zhì)及大部分肺泡腔內(nèi)有中性粒細胞聚集成團)，4分(>75%)。評分由兩名未參與實驗的病理科醫(yī)生進行，取平均值。

1.3.5 肺組織電鏡檢查 標本放入2.5%戊二醛 4℃固定過夜，經(jīng)漂洗后用10%明膠包埋固定，在4℃下用戊二醛固定1 h；脫水后用環(huán)氧樹脂浸透包埋，Leica UC6超薄切片機切片。最后在110 kV的條件下，用透射電子顯微鏡觀察肺組織并拍攝照片。

1.3.6 TUNEL法檢測肺組織中性粒細胞凋亡率 肺組織固定于10%甲醛過夜。脫水、包埋后對標本進行切片，厚度8～10 μm。冰凍切片放入4%多聚甲醛液室溫固定30 min。加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用PBS 1∶9稀釋)覆蓋組織，37℃溫箱孵30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，PBS洗3次。切片上滴加TUNEL試劑，濕盒內(nèi)37℃恒溫孵育2 h。每張切片加適量試劑3(Streptavidin-Fluorescein)覆蓋組織，濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育30 min。PBS洗3次。加入0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍。然后滴加與二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS洗3遍。添加抗中性粒細胞表面特異性蛋白CD177試劑，4℃濕盒內(nèi)過夜，PBS洗3遍。二抗孵育室溫2 h(避光)，PBS洗3遍。最后用DAPI染核10 min，PBS洗3遍，然后直接照熒光片。

1.3.7 免疫印跡法 取出-80℃保存的肺組織，每組各取約100 mg加人約1mL預(yù)冷蛋白裂解液，12 000 rpm離心15 min，取上清，BCA法測蛋白濃度并定量。每組蛋白取40μg上樣于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，以濃縮膠100 V，30 min、分離膠120 V，60 min電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。TBS洗膜5 min，置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，將膜分別放入一抗兔抗大鼠AnxA1抗體(1∶1 000)和兔抗大鼠β-actin抗體(1∶1 000)，4℃冰箱孵育過夜。TBST液漂洗3次，每次10 min，加入二抗HRP標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)，37℃孵育1 h。TBST漂洗3次，與顯影液反應(yīng)后，化學發(fā)光儀檢測，采用Image J軟件進行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，用目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時點生命體征的變化

2.1.1 心率的變化 各組同時點比較：各組大鼠在T1時刻，心率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在T2及T3時間點，WT-IR組心率較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組心率較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2及T3時點心率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組不同時點比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時點心率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；WT-IR組和KO-IR組隨著時間點推移，心率逐漸降低且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

組別T1T2T3WT-Sham381.67±31.48357.50±37.87360.00±38.60WT-IR375.83±33.30#251.00±41.24?a165.17±39.82?#aKO-Sham363.83±39.42349.83±33.44343.67±32.71KO-IR386.67±34.04#235.17±35.49?b155.50±35.22?#b

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時點WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時點KO-Sham組比，b：P<0.05。

2.1.2 平均動脈壓的變化 各組同時點比較：各組大鼠在T1時刻，MAP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在T2及T3時間點，WT-IR組MAP較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組MAP較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2及T3時點MAP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組不同時點的比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時點MAP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，WT-IR組和KO-IR組隨著實驗進行，在T2及T3時刻MAP較T1明顯降低(P<0.05)，兩組T3和T2時刻MAP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

組別T1T2T3WT-Sham81.83±8.2376.50±6.8983.83±9.35WT-IR 8.83±10.19#55.67±7.87?a63.17±7.17#?aKO-Sham86.33±8.8081.17±7.7684.83±9.02KO-IR83.17±7.55#54.83±7.11?b59.00±8.65?b

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時點WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時點KO-Sham組比，b：P<0.05。

2.2 各組大鼠氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)的變化 各組同時點比較：各組大鼠在T1時刻，OI和RI差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在T2及T3時間點，WT-IR組OI較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組OI較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR組RI較WT-Sham組明顯升高(P<0.05)，KO-IR組RI較KO-Sham組明顯增加(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2時間點OI及RI差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在T3時刻，KO-IR組OI明顯低于WT-IR組(P<0.05)，而RI顯著高于WT-IR組(P<0.05)；各組不同時點比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時點OI、RI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；WT-IR組和KO-IR組隨著時間點推移，OI逐漸降低差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RI逐漸升高差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3～4。

組別T1T2T3WT-Sham428.33±37.88411.50±27.49414.17±22.78WT-IR445.33±30.75#227.17±39.95?a135.67±27.71?#aKO-Sham424.83±33.77405.17±30.75410.00±39.48KO-IR436.67±32.20#212.00±27.47?b100.67±21.48?#bc

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時點WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時點KO-Sham組比，b：P<0.05；與同時點W-IR相比，c:P<0.05。

組別T1T2T3WT-Sham0.34±0.100.39±0.080.37±0.07WT-IR0.29±0.11#1.59±0.41?a3.35±0.90?#aKO-Sham0.33±0.100.40±0.090.41±0.13KO-IR0.33±0.11#1.66±0.39?b4.55±0.95?#bc

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時點WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時點KO-Sham組比，b：P<0.05；與同時點W-IR相比，c:P<0.05。

2.3 各組大鼠肺組織形態(tài)改變及病理損傷評分

2.3.1 肺組織形態(tài)學改變及病理評分 (H&E)染色光鏡下觀察T3時刻WT-Sham和KO-Sham組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，可見少量肺泡壁斷裂及炎性滲出；病理損傷評分WT-Sham組(1.67±0.52)及KO-Sham組(1.83±0.61)差異無統(tǒng)計學意義。WT-IR組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂嚴重，肺泡腔充滿水腫液，可見大量炎性細胞和紅細胞浸潤；KO-IR組肺組織結(jié)構(gòu)受損嚴重，肺泡間隔增寬，肺泡腔見大量炎性細胞和紅細胞浸潤，且觀察到炎性細胞聚集成團；KO-IR組病理損傷評分(4.91±0.20)高于WT-IR組(4.58±0.20)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1～2。

A：WT-Sham組；B：WT-IR組；C：KO-Sham組；D：KO-IR組。圖1 各組大鼠T3時刻肺組織光鏡改變(×200)

與WT-Sham組比較，a：P<0.05；與KO-Sham組比較，b：P<0.05；與WT-IR組比較，c：P<0.05。圖2 各組大鼠肺組織損傷評分比較

2.3.2 肺泡II型上皮細胞形態(tài)的改變 電鏡下觀察到T3時刻WT-Sham和KO-Sham組肺泡II型上皮細胞整體輪廓清楚，界限清晰，胞內(nèi)可見數(shù)個結(jié)構(gòu)完好的板層小體結(jié)構(gòu)，無線粒體腫脹。在WT-IR組電子顯微鏡下，觀察到肺泡II型細胞板層結(jié)構(gòu)數(shù)減少，腫脹增多，可見線粒體水腫。KO-IR組電鏡下可見肺泡II型細胞數(shù)量較WT-IR組減少，并觀察到肺泡II型上皮細胞出現(xiàn)壞死，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)細胞碎片，特異性結(jié)構(gòu)板層小體的平行排列板消失，線粒體腫脹明顯，膜外可見殘余的絨毛結(jié)構(gòu)(見圖3)。

A：WT-Sham組；B：WT-IR組；C：KO-Sham組；D：KO-IR組。嗜鋨性板層小體(紅色箭頭)；線粒體(黃色箭頭)；細胞碎片(藍色箭頭,bar=2 μm)。圖3 各組大鼠T3時刻肺組織電鏡改變

2.4 大鼠肺組織中性粒細胞細胞凋亡 在WT-Sham組和KO-Sham組僅觀察到少量中性粒細胞，未發(fā)現(xiàn)凋亡的中性粒細胞。WT-IR和KO-IR組觀察到中性粒細胞的凋亡，KO-IR組中性粒細胞的凋亡率(6.32±2.57%)相較于WT-IR組(17.72±6.35%)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖4～5。

2.5 大鼠肺組織AnxA1的表達 T3時刻WT-IR組肺組織中AnxA1/β-Actin表達(1.43±0.32)明顯高于WT-Sham組(0.93±0.42)，KO組因為敲除了相關(guān)基因，肺組織中并未檢測到AnxA1的表達(見圖6)。

與WT-IR組相比，a：P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織中性粒細胞凋亡率統(tǒng)計

圖5 TUNEL法檢測中性粒細胞凋亡結(jié)果(×200)

與WT-Sham組相比，a：P<0.05。 圖6 各組大鼠T3時點肺組織AnxA1的表達

3 討論

急性肺損傷是CPB后常見的并發(fā)癥之一，其主要表現(xiàn)是肺功能受損和肺組織病理學改變。臨床上常用OI和RI來評價肺功能。RI和OI之間存在負相關(guān)，兩者的變化都可以反映肺功能的變化。本實驗血氣分析計算顯示：隨著實驗時間的延長，WT-IR組和KO-IR組大鼠的OI逐漸下降低，明顯低于CPB前；RI 則相反；而WT-sham和KO-Sham組各時點OI和RI無明顯差異，提示CPB后大鼠肺功能明顯受損。但在實驗結(jié)束時，KO-IR組OI明顯低于WT-IR組，而RI顯著高于WT-IR組，說明AnxA1基因敲除大鼠CPB后肺功能受損比野生型大鼠嚴重。病理切片顯示CPB后WT-IR組及KO-IR組均有肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁斷裂，肺泡腔充滿水腫液，可見大量炎性細胞和紅細胞浸潤；但KO-IR組肺組織病理評分明顯高于WT-IR組。肺泡Ⅱ型上皮細胞作為肺泡上皮的祖細胞，不僅可以自我更新，在損傷修復(fù)過程中還可以分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞[8]，肺泡Ⅱ型上皮細胞通過合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)，維持肺泡的穩(wěn)定性，在肺內(nèi)免疫中起關(guān)鍵作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，在膿毒癥導(dǎo)致小鼠急性肺損傷的模型中，因肺泡II型上皮細胞的受損，增加了肺泡氣-血屏障的通透性，從而導(dǎo)致肺泡腔和肺間質(zhì)水腫、出血，大量中性粒細胞和肺泡巨噬細胞浸潤，加重肺損傷。本實驗電子顯微鏡下觀察到兩組大鼠肺泡II型細胞板層結(jié)構(gòu)視野數(shù)減少，腫脹增多，可見線粒體水腫；KO-IR組可見肺泡II型細胞數(shù)量較WT-IR組減少，并觀察到肺泡II型上皮細胞出現(xiàn)壞死，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)細胞碎片，特異性結(jié)構(gòu)板層小體的平行排列板消失，線粒體腫脹明顯，膜外可見殘余的絨毛結(jié)構(gòu)，KO-IR組肺泡II型上皮細胞受損嚴重。以上結(jié)果提示：AnxA1基因敲除后加重了大鼠CPB肺損傷。

在CPB期間，血液與CPB人工回路表面的直接接觸會引起全身炎癥反應(yīng)和肺循環(huán)系統(tǒng)中性粒細胞的逐漸積累，中性粒細胞-內(nèi)皮細胞相互作用，促進炎癥因子和氧自由基的釋放導(dǎo)致組織損傷[11]。中性粒細胞凋亡被認為是炎癥消散的關(guān)鍵,是機體自我限制炎癥反應(yīng)的一種重要方式。有研究表明，CPB開始后中性粒細胞凋亡明顯減少,且隨著CPB時間增加，中性粒細胞凋亡率逐漸下降[12]。 CPB后滯留在肺內(nèi)的中性粒細胞凋亡受到抑制,生命周期延長,始終處于活化狀態(tài),持續(xù)釋放大量具有組織毒性及酶解基質(zhì)蛋白作用的內(nèi)容物，加重肺組織損傷[13]。CPB后肺組織中性粒細胞凋亡延遲是導(dǎo)致肺損傷的重要因素。

AnxA1是一種重要的內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，在正常條件下，AnxA1主要位于細胞質(zhì)中無活性，發(fā)生炎癥時，中性粒細胞與毛細血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，刺激大量AnxA1移動到細胞表面與粘附分子相互作用，通過介導(dǎo)炎癥細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用，從而抑制炎癥細胞向炎癥部位聚集，調(diào)節(jié)機體自身的抗炎作用。AnxA1在中性粒細胞、單核細胞、嗜酸細胞和漿細胞的胞漿中高表達[14]，可通過誘導(dǎo)中性粒細胞的凋亡調(diào)節(jié)炎癥的消退。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠急性胸膜炎的實驗中，內(nèi)源性AnxA1通過激活caspase-3及抑制erk1 /2磷酸化等相關(guān)通路促進中性粒細胞的凋亡，從而抑制了炎癥[15]。本實驗結(jié)果顯示，WT-IR組和 KO-IR組大鼠CPB 后均觀察到肺組織中性粒細胞的凋亡，但WT-IR組中性粒細胞的凋亡率明顯高于KO-IR組，同時WT-IR組大鼠肺功能及肺組織受損程度比KO-IR組輕；WT-IR組大鼠肺組織AnxA1的表達明顯高于WT-sham組，KO-IR及KO-sham肺組織未檢測到AnxA1的表達。說明CPB后WT-IR組大鼠肺組織AnxA1的表達增加，可促進中性粒細胞的凋亡，肺損傷程度減輕。AnxA1基因敲除后中性粒細胞的凋亡延遲，肺損傷程度加重。提示：內(nèi)源性的AnxA1通過促進中性粒細胞的凋亡，對CPB肺損傷有積極的抗炎作用。

綜上所述，本研究通過觀察AnxA1基因敲除型大鼠與野生型大鼠CPB后對肺損傷的影響，發(fā)現(xiàn)基因敲除型大鼠肺損傷明顯加重，提示內(nèi)源性AnxA1對CPB肺損傷有一定積極的作用。因此深入研究AnxA1或其擬肽藥有望成為CPB肺損傷的一種新的保護策略。