高勇強(qiáng)，李春鳴，鄒盛楠，梁 娜，張 萌，何曉鳳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099)

胃癌是全世界最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，位居消化道腫瘤的首位[1-2]，是全球第三大死亡原因[3]；據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)為東亞，且治愈率偏低。由于大多數(shù)胃癌早期無明顯癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已處于疾病進(jìn)展期，發(fā)生全身多處轉(zhuǎn)移或局部浸潤，往往失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)。因此，尋找胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，探索潛在的胃癌基因治療靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

KAI1基因是近年來研究較多的一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，最初是在前列腺癌研究中被發(fā)現(xiàn)，近年來多數(shù)研究表明，它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的粘附、抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老與凋亡等方式來抑制多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。本課題組前期已篩選出KAI1高表達(dá)胃癌細(xì)胞株MKN28及低表達(dá)細(xì)胞株BGC823[4]。本研究將承接課題組前期試驗(yàn)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染方法將BGC823胃癌細(xì)胞株中低表達(dá)的KAI1基因過表達(dá)，將MKN28胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)的KAI1基因沉默，并建立兩種細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。通過Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，再進(jìn)一步結(jié)合體外MTT、Transwell等實(shí)驗(yàn)分析KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的體外生長遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 ①細(xì)胞株：低表達(dá)KAI1基因人胃癌細(xì)胞BGC823；高表達(dá)KAI1基因人胃癌細(xì)胞MKN28，由遵義醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室保存。②慢病毒載體：過表達(dá)載體pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-KAI1-3Flag和RNA干擾載體pCMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA(KAI1)購自上海和元生物公司。

1.2 主要試劑 FBS胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；兔抗人KAI1單克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人Tubulin單克隆抗體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒購自北京全式金生物； MTT試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、Western blot相關(guān)試劑購自Solarbio公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物購自Millipore公司；KAI1、Actin正反向引物由北京擎科生物科技有限公司合成；Transwell小室(24孔板)購自美國康寧。

1.3 主要設(shè)備及儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、MHG-100B型熒光顯微鏡(日本 Olympus公司)、低溫高速離心機(jī)(德國EPPendorf Centrifuge公司)、MULTISKAN GO酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、實(shí)時(shí)定量 PCR 儀、蛋白曝光系統(tǒng)(美國 BIO-RAD公司)、流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 配置含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基將人胃癌BGC823細(xì)胞、人胃癌MKN28細(xì)胞置于37℃恒溫、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次，待觀察細(xì)胞貼壁長至80%以上時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.4.2 構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 將狀態(tài)良好的BGC823、MKN28細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于24孔板中，每孔500 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的兩種細(xì)胞慢病毒感染最佳MOI值(BGC823細(xì)胞10、MKN28細(xì)胞40)，將慢病毒原液用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋并加入終濃度為5 μg/mL的polybrene。吸棄24孔板中的培養(yǎng)基，將兩種細(xì)胞各分為3組，每孔加入含有目的基因載體的病毒原液培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組(OE組)；加入含有空載體病毒原液的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組(NC組)；加入不含有病毒原液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組(Ctrl組)。孵育24 h后更換完全培養(yǎng)基，每天換液。病毒感染72 h后每日在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)弱判斷慢病毒感染目的細(xì)胞的效率，當(dāng)感染率達(dá)到80%時(shí)，更換含有最佳致死濃度(1 μg/mL)嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每日換液并加入新鮮的嘌呤霉素。待Ctrl組中的細(xì)胞完全死亡時(shí)，擴(kuò)增OE組和NC組即得到穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中KAI1mRNA表達(dá) 收集BGC823、MKN28各組細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，并進(jìn)行濃度及純度測(cè)定。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR，共40個(gè)循環(huán)(95℃ 3min， 95℃ 10s，55℃ 30s)，2-△△Ct法相對(duì)定量分析，各組重復(fù)4次。KAI1及內(nèi)參Actin引物如下：KAI1上游：5′-TGTCCTGCAAACCTCCTCCA-3′；KAI1下游：5′-CCATGAGCATAGTGACT GCCC-3′；Actin上游：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′；Actin下游：5′-GGGCC GGACTCGTCATAC-3′。

1.4.4 Western blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中KAI1蛋白表達(dá) 將處在對(duì)數(shù)生長期的BGC823、MKN28各組細(xì)胞中加入預(yù)冷的PIPA裂解液，裂解細(xì)胞制備成勻漿，4℃離心取上清，用BCA法測(cè)定各蛋白樣品濃度，調(diào)整各樣品為相同濃度，加入5×上樣緩沖液，沸水中煮5min使蛋白變性，將變性蛋白用SDS-聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行分離，每孔上樣量為10 μL，再將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，使用BSA封閉轉(zhuǎn)好的膜2 h，加入KAI1一抗(兔抗人一抗按1∶1 000倍數(shù)稀釋)4℃孵育過夜，次日用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(羊抗兔二抗1∶10 000倍數(shù)稀釋)常溫?fù)u床孵育1.5 h，1×TBST洗膜3次，每次15分鐘。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影曝光，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。通過解析條帶灰度值，對(duì)KAI1蛋白進(jìn)行結(jié)果分析，以β-tubulin為內(nèi)參照。

1.4.5 MTT檢測(cè)KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖的影響 用胰酶消化BGC823、MKN28各組細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞、體積100 μL的標(biāo)準(zhǔn)加入到96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。觀察到細(xì)胞貼壁后，分別于第0、24、48、72小時(shí)在每孔中加入20 μL濃度為5 mg/L的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后吸取上清液，在每孔中加入100 μL DMSO溶液，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長處各孔吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

1.4.6 Transwell檢測(cè)KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞遷移的影響 用胰酶消化BGC823、MKN28各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度，每個(gè)Transwell上室中加入200 μL的5×104個(gè)細(xì)胞，下室加入550 μL的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第2天小心取出小室，PBS清洗晾干后，用多聚甲醛室溫固定30 min；再用結(jié)晶紫室溫染色15 min，清水清洗后晾干、切膜，放入載玻片上用中性樹膠封片，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野用IPWIN32計(jì)數(shù)。

1.4.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞周期的影響 用胰酶消化離心收集BGC823、MKN28各組細(xì)胞，PBS清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液，再次離心去除上清，加入預(yù)冷的70%乙醇500 μL固定4℃保存過夜。次日取出固定后的細(xì)胞離心清洗，在細(xì)胞沉淀中加入100 μLRNase A溶液，重懸細(xì)胞，37℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色液，混勻，4℃避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BGC823、MKN28細(xì)胞各組的感染情況 病毒感染72 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)弱判斷慢病毒感染率達(dá)到80%，每組更換含有最佳致死濃度(1 μg/mL)嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至Ctrl組中的細(xì)胞完全死亡時(shí)，擴(kuò)增篩選后的細(xì)胞如圖1所示。

A:BGC823-Ctrl組;B:BGC823-NC組;C:BGC823-OE組;D:MKN28-Ctrl組;E:MKN28-NC組;F:MKN28-OE組。圖1 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞收樣圖

2.2 各組細(xì)胞KAI1mRNA表達(dá)變化 BGC823-OE組KAI1mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC組與Ctrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MKN28-OE組的KAI1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于NC組與Ctrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與蛋白的相對(duì)表達(dá)結(jié)果相一致(見圖2)。

*：與NC組比較，P<0.05；#：與Ctrl組比較，P<0.05。圖2 KAI1mRNA在BGC823、MKN28細(xì)胞各組中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 各組細(xì)胞KAI1蛋白水平 人胃癌BGC823-OE組KAI1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC組與Ctrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；人胃癌MKN28-OE組KAI1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于NC組與Ctrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3)。

2.4 KAI1過表達(dá)和沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 分別于各組細(xì)胞在培養(yǎng)第0、24、48、72小時(shí)時(shí)加入MTT試劑并檢測(cè)光密度值，將各組0h的光密度值作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出各個(gè)時(shí)間段的相對(duì)增殖率(見圖4)。BGC823-OE組在24、48、72 h的相對(duì)增殖率明顯低于NC組與Ctrl組，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MKN28-OE組在24、48、72 h的相對(duì)增殖率明顯高于NC組與Ctrl組，同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩種細(xì)胞的NC組與Ctrl組的相對(duì)增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：與NC組比較，P<0.05；#：與Ctrl組比較，P<0.05。圖3 KAI1蛋白在BGC823、MKN28細(xì)胞各組中的相對(duì)表達(dá)量

*：與NC組比較，P<0.05；#：與Ctrl組比較，P<0.05。圖4 MTT法檢測(cè)KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖的影響

2.5 KAI1過表達(dá)和沉默對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響 BGC823-OE組的遷移細(xì)胞數(shù)目明顯少于NC組與Ctrl組，MKN28-OE組的遷移數(shù)目明顯多于NC組與Ctrl組，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；兩種細(xì)胞的NC組與Ctrl組遷移細(xì)胞數(shù)相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

2.6 KAI1過表達(dá)和沉默對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示BGC823-OE組S期占比明顯少于NC組與Ctrl組，MKN28-OE組S期占比明顯多于NC組與Ctrl組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種細(xì)胞的NC組與Ctrl組S期占比相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖6～7)。

A:BGC823-Ctrl組;B:BGC823-NC組;C:BGC823-OE組;D:MKN28-Ctrl組;E:MKN28-NC組;F:MKN28-OE組;*：與NC組比較，P<0.05；#：與Ctrl組比較，P<0.05。圖5 BGC823、MKN28各組細(xì)胞遷移能力對(duì)比

A:BGC823-Ctrl組;B:BGC823-NC組;C:BGC823-OE組;D:MKN28-Ctrl組;E:MKN28-NC組;F:MKN28-OE組。圖6 BGC823、MKN28各組細(xì)胞周期對(duì)比

*：與NC組比較，P<0.05；#：與Ctrl組比較，P<0.05。圖7 BGC823、MKN28各組細(xì)胞S期占比對(duì)比

3 討論

1995年Dong等[5]從鼠前列腺癌細(xì)胞AT6.1中分離出一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，即 KAI1，又稱CD82,其能夠在不影響原發(fā)性腫瘤形成的情況下抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。KAI1基因定位于人染色體11p11.2，大小約80 kb，包含了10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。KAI1基因編碼了一個(gè)267個(gè)氨基酸所組成的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量29 600道爾頓，屬于四次跨膜超家族(TM4SF)的成員。研究表明，許多發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥當(dāng)中，KAI1基因均呈現(xiàn)持續(xù)性低表達(dá)或不表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KAI1可以通過作用于Src激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間的粘附，除此之外還可以通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞上的β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)來穩(wěn)定或增強(qiáng)E-鈣粘蛋白依賴性細(xì)胞間粘附，防止癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤部位脫離，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[6-7]。此外，KAI1基因可以降低細(xì)胞膜上α6整合素的表達(dá)，導(dǎo)致其與層粘連蛋白的粘附性降低進(jìn)而干擾細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力與粘附能力[8]，還能夠通過與整合素β1相互作用，干擾整合素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，抑制纖連蛋白誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲能力降低[9]。另有研究證明[10]，KAI1基因可以通過與趨化因子達(dá)菲抗原受體(DARC)的相互作用使腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性增強(qiáng)從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并通過調(diào)節(jié)TBX2和p21的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制與衰老從而阻斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明KAI1基因可以通過不同的途徑來抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本課題組前期篩選出了高表達(dá)KAI1的高分化胃腺癌細(xì)胞株MKN28和低表達(dá)KAI1的低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823，實(shí)驗(yàn)證實(shí)MKN28細(xì)胞的生長遷移能力明顯弱于 BGC823細(xì)胞。由此推測(cè)，KAI1基因可能參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的體外生長與遷移。為進(jìn)一步明確KAI1基因?qū)Σ煌赴┘?xì)胞體外生長遷移能力的影響，本課題用含有KAI1過表達(dá)載體的慢病毒感染人胃癌BGC823細(xì)胞，用含有KAI1 RNA干擾載體的慢病毒感染人胃癌MKN28細(xì)胞，感染后篩選擴(kuò)增得到穩(wěn)轉(zhuǎn)的人胃癌BGC823、 MKN28細(xì)胞株，并通過蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行KAI1蛋白和mRNA表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果顯示人胃癌BGC823-OE組細(xì)胞的KAI1表達(dá)較NC組和Ctrl組上調(diào)，人胃癌MKN28-OE組細(xì)胞的KAI1較NC組和Ctrl組表達(dá)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩種細(xì)胞NC組和Ctrl組KAI1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè)證明人胃癌BGC823-OE組細(xì)胞的相對(duì)增殖率明顯低于NC組和Ctrl組，人胃癌MKN28-OE組細(xì)胞的相對(duì)增殖率明顯高于NC組和Ctrl組(P<0.05)，同時(shí)Transwell實(shí)驗(yàn)顯示人胃癌BGC823-OE組細(xì)胞較NC組和Ctrl組遷移能力明顯下降，人胃癌MKN28-OE組細(xì)胞的遷移能力則明顯強(qiáng)于NC組和Ctrl組(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人胃癌BGC823-OE組細(xì)胞S期占比也顯著高于NC組和Ctrl組，人胃癌MKN28-OE組細(xì)胞S期占比較NC組和Ctrl組顯著下降(P<0.05)。弭延斌等[11]研究發(fā)現(xiàn)，KAI1基因沉默后的人胰腺癌細(xì)胞，其體外生長、遷移能力明顯強(qiáng)于空白組與陰性對(duì)照組；陳鋒等[12]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KAI1基因?qū)θ四I透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O增殖有顯著抑制作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

本研究成功建立了穩(wěn)定上調(diào)KAI1基因的人胃癌BGC823細(xì)胞株和穩(wěn)定沉默KAI1基因的人胃癌MKN28細(xì)胞株，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)KAI1 基因表達(dá)量能降低胃癌細(xì)胞株生長遷移能力，反之則增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株生長遷移能力。這與本課題前期研究得出的不同胃癌細(xì)胞中KAI1基因的表達(dá)量與胃癌細(xì)胞生長遷移能力成反比的結(jié)果一致，由此我們推測(cè)，KAI1基因有負(fù)向調(diào)控胃癌細(xì)胞體外生長和遷移的能力，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。本課題實(shí)驗(yàn)為后續(xù)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建動(dòng)物模型及研究KAI1基因具體分子作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。