張永芳， 張 飄， 蔣 嫻， 米文琴， 冉越宇， 楊 浪， 姜海波， 文 明，2*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

鱘魚源于白堊紀(jì)時期的古老軟骨鱗魚，為硬骨魚綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱 (Actinopterygii)軟骨硬鱗總目(Chondrostei)鱘形目(Acipenseriformes)的成員，其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者的喜愛[1]。近年來，貴州省冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)特別是雜交鱘養(yǎng)殖得到快速發(fā)展，但雜交鱘疾病特別是細(xì)菌性疾病的危害也愈來愈大，因此細(xì)菌性疾病的防治研究成為保障鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重點之一。

抗菌肽(AMPs)是1類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)，是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[2]。自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)第1個抗菌肽即天蠶素(cecropins)并證明其具有抑菌作用后，迄今已發(fā)現(xiàn)2 000多種天然抗菌肽[3，4]。由于抗菌肽具有廣譜的抗菌活性和較大的研發(fā)價值，有關(guān)抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究報道較多，如盲鰻(Myxineglutinosa)、虹鱒(Oncorhynchus)、大西洋鮭(Salmosalar)等的應(yīng)用研究[5～7]，而對鱘魚的應(yīng)用研究鮮有報道。本試驗以維氏氣單胞菌人工感染雜交鱘，檢測分析抗菌肽在感染雜交鱘體內(nèi)組織的含量動態(tài)規(guī)律，以期為抗菌肽在鱘魚養(yǎng)殖上的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、菌種及試劑(1)實驗用雜交鱘：購自貴州大學(xué)水產(chǎn)研究所，共20尾，體重0.7～0.8 kg，體長(55±5)cm，于室內(nèi)水族箱中養(yǎng)殖， 養(yǎng)殖水使用循環(huán)泵和充氣泵。(2)實驗用維氏氣單胞菌菌種：貴州大學(xué)動物疫病研究所惠贈，-80 ℃超低溫冰箱15%甘油保存。(3)主要試劑：腦心浸液(BHI)肉湯培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；抗菌肽ELISA檢測試劑盒，購于江蘇綠葉生物科技有限公司。

1.2 維氏氣單胞菌菌種復(fù)蘇取保存的維氏氣單胞菌菌種1 mL于滅菌BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3 雜交鱘人工感染與樣品采集取雜交鱘隨機分為2組：正常對照組、人工感染組。正常對照組5尾，腹腔注射滅菌BHI培養(yǎng)液0.2 mL/尾；人工感染組15尾，腹腔注射維氏氣單胞菌液0.2 mL/尾。人工感染組分別在感染后24、48、96 h采集脾臟、肝臟、心臟、肌肉、腸道、鰓組織樣品；正常對照組在96 h 采集。各組織樣本置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽含量測定首先按照抗菌肽ELISA檢測試劑盒說明書，以抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，建立抗菌肽含量與D450 nm值線性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。然后取保存的雜交鱘組織樣品，剪取各組織樣品10 g于研缽中，加入生理鹽水 1.0 mL，研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒檢測步驟測定組織樣品中的抗菌肽D450 nm值，分析抗菌肽含量變化動態(tài)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析收集正常對照組和人工感染組雜交鱘各個組織抗菌肽含量檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以p-Value為依據(jù)，判定其是否具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按照抗菌肽ELISA檢測試劑盒說明書，取抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋為待測樣品進(jìn)行ELISA檢測，計6個稀釋度，每個稀釋度測3個重復(fù)，以抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(含量)為橫坐標(biāo)，每個稀釋度D450 nm值為縱坐標(biāo)，建立抗菌肽含量與D450 nm值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。經(jīng)測算，抗菌肽含量與其D450 nm值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=288.18x-3.157(R2=0.992 4)。

2.2 人工感染雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽含量動態(tài)分析由表1、圖2可見：(1)正常對照組6個組織均有抗菌肽表達(dá)，其中在鰓和腸道組織中含量最高，而在肝臟中含量最低。(2)與正常對照組比較，人工感染組雜交鱘6個組織抗菌肽含量在不同時間段上均呈明顯升高，差異顯著(P<0.05)。其中：在24 h和96 h鰓和腸道組織抗菌肽含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)；在48 h肝臟、肌肉、心臟、脾臟抗菌肽含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。

表1 各組雜交鱘體內(nèi)組織抗菌肽D450 nm值

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；肩標(biāo)相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相間字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明：雜交鱘在維氏氣單胞菌感染后其機體內(nèi)抗菌肽含量顯著升高，提示抗菌肽在雜交鱘抗細(xì)菌感染中可能發(fā)揮著重要作用，這為今后抗菌肽在雜交鱘產(chǎn)業(yè)疾病防控中的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

4 討論

4.1抗菌肽不僅具有抗菌功能，而且還對真菌、病毒和腫瘤具有一定的抑制作用，因此抗菌肽愈來愈受到養(yǎng)殖行業(yè)的重視。目前有關(guān)魚類抗菌肽研究資料較多，但大多是從mRNA水平上開展研究，較少從蛋白水平進(jìn)行研究分析。在外界因素刺激下(包括病原微生物感染)，動物機體(包括魚類)的抗菌肽基因mRNA水平可能得到明顯提升，但不一定有效地表達(dá)出抗菌肽[8]。因此，采用實時熒光定量PCR方法進(jìn)行抗菌肽基因水平的檢測，并不能真實反映動物機體抗菌肽含量變化。

4.2本實驗采用ELISA方法檢測人工感染維氏氣單胞菌后雜交鱘6個組織器官抗菌肽的含量發(fā)現(xiàn)：正常對照組和人工感染組雜交鱘鰓和腸中抗菌肽含量較其他組織高，且人工感染組極顯著高于正常對照組(P<0.01)。這與李偉等[9]研究正常牙鲆的結(jié)果“肝、鰓和脾等抗菌肽含量較高，而心和腸抗菌肽含量較低”不盡一致，可能是由于雜交鱘的鰓和腸與外界病原微生物接觸機會較多，受到刺激后產(chǎn)生的抗菌肽含量就會相對較高。本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：無論是正常對照組還是人工感染組，雜交鱘肌肉組織的抗菌肽含量較心臟、脾臟、肝臟組織的含量高。這可能是本實驗在采集肌肉組織時未能完全剝離皮膚組織，而魚類皮膚組織表面黏液抗菌肽含量相對較高，從而導(dǎo)致本實驗檢測的肌肉組織抗菌肽含量相對較高。有研究資料表明，某些魚類體內(nèi)抗菌肽還具有針對性，如石斑魚抗菌肽主要針對氣單胞菌[10]。本實驗只進(jìn)行了單一維氏氣單胞菌感染雜交鱘的抗菌肽含量變化分析，要明確雜交鱘抗菌肽是否具有針對性，還需進(jìn)一步實驗證實。