張婷婷，徐然，江麗，高湘旻，葉明燈，童寧，鄭楓

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院藥學部，南京市第二醫(yī)院藥學部，南京 210003；2.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，南京 211100；3.中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院藥劑科，南京 210042；4.中國藥科大學藥物分析系，南京 210009)

反式氧化樟腦(trans-π-oxocamphor，TOC)系樟腦的活性代謝產物，可由其半合成衍生而來[1]。以TOC為主要成分的氧化樟腦注射液(Vitacamphorae injection)是一種中樞興奮劑，可興奮延腦呼吸中樞和血管運動中樞，因其能有效改善心肌代謝，改善心肌收縮力，清除氧自由基，改善缺氧后再給氧所致的心肌損傷[2]，被廣泛用于治療中樞性呼吸困難及循環(huán)衰竭，也可用于各種疾病所致的心力衰竭(心衰)和呼吸循環(huán)衰竭[3]。TOC通過收縮內臟血管和舒張皮膚血管，使血壓上升；通過加強心臟收縮，恢復心臟節(jié)律，增加每分鐘心輸出量，從而起到刺激心臟功能和幫助恢復正常循環(huán)的作用[4]。據臨床使用回顧性分析，心血管內科主要用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；腎病內科、神經內科、呼吸內科等其他內科科室用于慢性阻塞性肺疾病、心衰、高血壓心臟病等疾病導致的呼吸困難及胸悶癥狀[5]。另有臨床研究表明氧化樟腦注射液與環(huán)磷酰苷葡胺聯(lián)用可以使血清NT-proBNP、cTnT、β-EP、IL-1β 水平均顯著降低，而VEGF、IGF-1 水平顯著升高，治療心力衰竭效果比單用環(huán)磷酰苷葡胺更明顯[6]。當TOC大量作用于大腦皮質運動區(qū)及腦干時易引起癲樣驚厥[7-8]。

盡管TOC已經在臨床應用了幾十年，但國內外藥典均未收載該品種，且關于它體內藥物分析的研究也十分有限，氧化樟腦注射液的藥品說明書中“藥動學”項下為“本品未進行該項實驗且無可靠參考文獻”。主要原因是TOC含醛基，具有化學不穩(wěn)定性和代謝不穩(wěn)定性[9]，長時間暴露在空氣中易被氧化成羧酸，人體經皮下注射后在體內代謝為醇和酸，并和葡萄糖醛酸結合經尿排泄[10]。加之TOC具有低極性和易揮發(fā)性，加大了分析難度。目前已有文獻中使用HPLC-UV測定氧化樟腦注射液的有關物質[11]，但并未應用于生物樣品分析。氣相色譜聯(lián)用質譜(gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS)非常適用于分析小分子、低極性和易揮發(fā)的物質[12-15]。TOC屬于雙環(huán)單萜類小分子活性藥物，沸點較低，且臨床上給藥劑量小，故本文選擇靈敏度高特異性強的GC-MS法測定大鼠血漿中TOC含量，并研究TOC在大鼠體內的藥動學參數(shù)，從而為其在人體內研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 電子天平(BT25S，賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)；渦旋混合器(XW-80A，上海醫(yī)大儀器有限公司)；高速冷凍離心機(ST-16R，Thermo Fisher公司)；氣質聯(lián)用儀(GCMS-QP2020，島津公司)。

1.2藥品、試劑與動物 反式氧化樟腦對照品(含量99.87%，長春大政藥業(yè)科技公司)；氧化樟腦注射液(2 mL：10 mg，批號：170501，長春大政藥業(yè)科技公司)；甲苯(內標，色譜純，批號：610585，Thermo Fisher公司)；無水乙醇、乙酸乙酯均為分析純；6只Sprague Dawley大鼠(雄性)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司南京分公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]，8～11周齡，體質量范圍(270±20)g，常規(guī)條件飼養(yǎng)。

2 方法與結果

2.1色譜條件與質譜條件 色譜柱為安捷倫HP-5MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣(純度為99.99%)；載氣流速為1.11 mL·min-1；進樣口溫度：275 ℃；進樣模式為分流進樣，進樣量1 μL，分流比為3：1。升溫程序：起始溫度70 ℃保持1.3 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至170 ℃并保持2.5 min。質譜接口溫度300 ℃，離子源EI溫度為280 ℃，電子轟擊能量70 eV。選擇單離子監(jiān)測(SIM)模式掃描，正離子方式檢測，選擇監(jiān)測的離子m/z95(TOC)和m/z91(內標)。

2.2溶液的配制 ①系列對照品溶液的配制。精密稱取反式氧化樟腦對照品10 mg，置于棕色量瓶中，用無水乙醇溶解稀釋制備成1000 μg·mL-1溶液作為TOC儲備液，用無水乙醇依次稀釋儲備液，可得到濃度為0.5～50 μg·mL-1TOC系列對照品溶液，密封并避光，于4 ℃冰箱中保存。②內標溶液的配制。精密量取甲苯115 μL置于棕色量瓶中，用無水乙醇定容，得到1000 μg·mL-1內標儲備液。取內標儲備液用無水乙醇定量稀釋成10 μg·mL-1內標溶液。

2.3校正標準樣品與質控樣品的制備 精密吸取空白大鼠血漿40 μL，加入對照品系列溶液10 μL，得到0.1～10 μg·mL-1系列校正標準樣品。同法制備得0.2，1.0，8.0 μg·mL-1的低濃度、中濃度和高濃度的質控(QC)樣品。

2.4血漿樣品處理 取含藥大鼠血漿(或“2.3”項下各血漿樣品)50 μL于EP管中，加入乙酸乙酯150 μL和內標工作液10 μL，渦旋30 s，在4 ℃半徑為4 cm的離心機上以轉速13 300 r·min-1離心5 min，取上清液1 μL進樣，進行GC-MS定量分析。由于TOC的化學性質不穩(wěn)定，大鼠血漿一經分取或校正標準樣品及QC樣品一經制備則應立即進行血漿樣品處理，并封閉避光冷藏。

2.5專屬性考察 取大鼠空白血漿，除不加內標溶液(改加同體積乙酸乙酯)外，其余按“2.4”項下操作，進行GC-MS分析，即得空白血漿色譜圖。通過比較大鼠空白血漿與最低定量下限(LLOQ)樣品和給藥后大鼠血漿樣品的典型色譜圖，考察方法的特異性與進樣殘留情況。典型色譜圖見圖1(A，B，C)。由圖可見TOC保留時間約為5.80 min，內標甲苯保留時間約為1.05 min。為考察進樣殘留情況，標準曲線最高濃度進樣后，分析空白大鼠血漿樣品，結果顯示干擾組分的響應低于當批次LLOQ待測物響應的20%及內標響應的5%，表明大鼠血漿中的內源性物質對待測物及內標的定量測定無干擾。本方法具有較高的特異性。

2.6線性范圍及定量下限 按“2.4”項下操作處理系列校正標準樣品，進行GC-MS分析，以TOC與內標峰面積比(Y)對待測物濃度(X，μg·mL-1)用加權最小二乘法(權重為1/χ2)進行線性回歸，計算線性回歸方程及其相關系數(shù)r，并繪制標準曲線。以血漿標準曲線的最低濃度點進行倍比稀釋，進樣測定，按S/N=10計，確定LLOQ。結果表明，TOC在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內濃度線性關系良好，典型回歸方程為：Y=0.864X+0.09(r=0.999 6)。以標準曲線的最低濃度點作為LLOQ，其代表性色譜圖見圖1B。在該濃度下，TOC色譜峰的信噪比(S/N)>10，準確度用相對誤差(RE)表示，平均為-4.82%，批內精密度為9.95%，批間精密度為10.33%，表明本方法測定大鼠血漿中的TOC最低定量限可以達到0.1 μg·mL-1。

A.空白血漿；B.LLOQ樣品；C.靜脈注射氧化樟腦注射液3.75 mg·kg-1后大鼠血樣

圖1 血漿樣品測定TOC典型色譜圖

A.blank plasma；B.LLOQ sample；C.blood sample after intravenous injection of vitacamphorae injection at 3.75 mg·kg-1in rats

Fig.1RepresentativechromatogramsofTOCinbloodsample

2.5.3回收率試驗與基質效應 配制低濃度、中濃度和高濃度的QC樣品，按“2.4”項操作，進樣測得峰面積(A1)，每一個濃度平行測定6份。將空白血漿樣品按“2.4”項下操作后，加入等體積相應濃度工作液進樣測得峰面積(A2)，每一個濃度平行測定6份。將濃度為0.2，1.0，8.0 μg·mL-1的溶液樣品加入相應內標溶液后直接進樣，得峰面積(A3)，每一個濃度平行測定6份。計算公式為：TOC回收率=A1/A2×100%，TOC基質效應=A2/A3×100%。大鼠血漿中TOC的低、中、高3個質量濃度的絕對回收率平均在76.94%～85.31%。其基質效應平均值在94.42%～98.05%，詳見表1，同時測定內標回收率為(96.56±0.56)%，基質效應為(98.77±5.32)%，提取率為95.37%，表明各質量濃度回收率較高，且無明顯基質效應，不會對樣品的分析產生影響。

表1 大鼠血漿中反式氧化樟腦的絕對回收率、基質效應及提取率

加入濃度/(μg·mL-1)絕對回收率x±s/%RSD/%基質效應x±s/%RSD/%提取率/%0.276.94±2.983.8894.42±8.228.7072.651.081.49±2.443.0097.23±1.602.3179.238.085.31±3.013.5398.50±2.012.0584.03

2.7準確度與精密度 配制LLOQ樣品及低、中、高濃度的QC樣品，按“2.4”項操作，進行GC-MS分析。連續(xù)考察3個分析批，每批、每個濃度平行操作6份，隨行標準曲線計算各樣品測得濃度，并計算批內批間精密度。大鼠血漿中TOC的LLOQ樣品及低、中、高3個質量濃度的QC樣品的準確度用相對誤差(RE)表示，范圍是-6.68%～2.02%，對應的批內、批間精密度RSD為1.45%～10.36%，結果詳見表2。均符合有關生物樣品分析方法驗證的要求。

2.8穩(wěn)定性考察 配制低、中、高濃度的QC樣品，分別考察血漿樣品處理后室溫條件下放置2 h、處理后4 ℃自動進樣器里放置8 h、-20 ℃冷凍放置3 d的穩(wěn)定性，各濃度樣品平行操作6份。計算質控樣品血漿實測值之間的相對差異。結果顯示穩(wěn)定性良好，準確度RE在-5.58%～1.74%之間，具體見表3。

2.9大鼠藥動學研究的應用 6只SD大鼠給藥前禁食不禁水12 h，根據不同種屬之間劑量換算以及預實驗結果，給予大鼠氧化樟腦注射液的劑量為3.75 mg·kg-1，經尾靜脈注射給藥，于給藥前及給藥后1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15 min由左股靜脈留置導管取血約0.3 mL置于含肝素鈉抗凝管中輕搖混勻，隨即在4 ℃下，半徑為4 cm的離心機上以轉速3500 r·min-1，離心10 min，分取血漿，處理測定，根據測定的濃度-時間關系采用DAS 2.1.1版軟件進行房室模型擬合，同一權重下，選擇AIC最小的進行模型擬合，并依照統(tǒng)計矩理論估算藥動學參數(shù)。平均血漿藥物濃度-時間曲線及擬合對數(shù)濃度-時間曲線見圖2，經計算機擬合，TOC的體內過程屬于二房室模型。按統(tǒng)計矩方法指導的非房室模型估算的主要藥動學參數(shù)如下：Cmax為(5.604±0.641)mg·L-1，AUC(0-t)為(20.459±2.034)mg·L-1·min，AUC(0-∞)為(21.683±2.029)mg·L-1·min，MRT(0-t)為(2.4±0.103)min，t1/2z為(6.938±3.093)min，清除速率CLz為(0.175±0.017)L·min-1·kg-1，表觀分布容積Vz為(1.744±0.847)L·kg-1?？梢?，TOC在大鼠體內經血消除速較快，并且AUC(0-t)和AUC(0-∞)相當，表明TOC在15 min內基本消除殆盡。

表2 大鼠血漿中反式氧化樟腦的準確度和精密度試驗結果

加入濃度/(μg·mL-1)測定濃度/(μg·mL-1)準確度(RE,%)精密度(RSD,%)批內批間0.10.093±0.009-6.6810.140.10.093±0.009-6.639.9510.330.10.098±0.010-1.1510.360.20.204±0.0092.024.610.20.201±0.0040.632.175.080.20.198±0.007-0.933.641.01.016±0.0391.583.801.01.004±0.0380.443.762.041.01.007±0.0260.732.588.07.981±0.115-0.241.458.08.008±0.1680.372.092.968.07.879±0.315-1.553.99

表3 各種條件下TOC含藥血漿樣品的穩(wěn)定性試驗結果

加入濃度/(μg·mL-1)處理后室溫放置2 h進樣器內4 ℃放置8 h-20 ℃凍存3 d0.20.198±0.0090.189±0.0100.192±0.0131.01.014±0.0220.980±0.0291.017±0.0328.08.048±0.1917.827±0.1817.912±0.261

圖2 大鼠單次靜脈注射氧化樟腦注射液3.57 mg·kg-1后的藥時曲線圖(n=6)

Fig.2Concentration-timecurveofTOCinratsaftersingleintravenousadministrationofvitacamphoraeinjectionat3.57mg·kg-1(n=6)

3 討論

3.1內標的選擇 以TOC沸點和其雙環(huán)單萜類結構為依據，選取水楊酸甲酯、環(huán)己酮和甲苯為內標進行考察，發(fā)現(xiàn)以水楊酸甲酯峰形不理想，且分析時間更長；環(huán)己酮則易受血漿中雜質干擾，影響生物樣品的測定；以甲苯作為內標，性質穩(wěn)定，提取率高，峰形對稱，無干擾。

3.2色譜優(yōu)化 雖然應用“2.1”項的程序升溫方法已獲得了滿意的分離效果，曾嘗試縮短分析時間，在其他參數(shù)保持不變的情況下，降低初始柱溫、提高升溫速率、縮短維持時間，運行總時間約為7.70 min。但是，控制系統(tǒng)會在該溫度下提示檢測器飽和報警。另外，在參數(shù)優(yōu)化中選擇一個合適的分流比非常重要。盡管較小的分流比率在一定程度上提高了靈敏度，但雜質進入色譜柱的量相比TOC 也會增加，這導致了高溫平臺清理時間的延長。

3.3提取方法的選擇 前文述及筆者查閱多方資料，均未發(fā)現(xiàn)有關TOC的生物樣品測定的可靠參考文獻。由于TOC屬于雙環(huán)單帖(莰烯類)含氧化合物，有較強的親脂性，而血漿中大多數(shù)內源性雜質是水溶性的，所以可利用待測物與內源性干擾物在有機溶劑中的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離。本實驗的樣品處理方法使用乙酸乙酯作為萃取劑，樣品經萃取后直接進樣，可除去血漿中大部分內源性干擾物質。但在樣品提取過程中，雖然待測組成分得到了凈化，但該提取液直接注入儀器時，可能達不到檢測器的靈敏度要求。在實際的體內樣品分析中，若體內樣品中待測成分的含量較小則樣品提取完成后可先通入氮氣流揮干萃取劑，殘渣再復溶濃集后進行分析。但在本實驗中由于TOC的易被氧化的特性，嘗試吹干濃集的過程中易引起醛基氧化，影響提取率，且步驟繁瑣，不太適合臨床快速準確的分析，因此本實驗選擇了乙酸乙酯萃取后直接進樣的方法，檢測限亦能達到分析要求。

3.4藥動學參數(shù)的臨床啟示 大鼠體內藥動學過程擬合結果為二室模型，其表觀分布容積約1.744 L·kg-1，清除速率為0.175 L·min-1·kg-1，可見TOC進入體內后迅速分布全身，并且迅速清除，同時少量可能進入血流較緩慢的靜態(tài)肌肉組或脂肪組織，致完整藥物分子吸收、分布和消除的體內平均滯留時間僅為約2.4 min。這和很多呼吸興奮劑及抗心衰藥物的作用維持時長類似，如呼吸興奮藥尼克剎米靜脈注射一次只維持5～10 min，進入體內后迅速代謝為煙酰胺再經甲基化成N-甲基煙酰胺而排出；如速效和短時作用的血管擴張藥硝普鈉，靜脈滴注后立即達到Cmax，因其代謝產物無擴張血管活性，停止給藥后藥效僅維持1～10 min。再如用于器質性心力衰竭的多巴酚丁胺，清除率高達244 L·h-1，半衰期約2 min，作為β1受體激動劑直接作用于心臟，在肝臟代謝為無活性化合物。值得注意的是靜脈滴注給藥方式可以延長其藥效至10 min，這一點可以給我們啟發(fā)。氧化樟腦注射液的說明書中推薦的給藥方式是“靜脈注射，肌內注射和皮下注射”，臨床上用于治療慢性心力衰竭、肺心病、穩(wěn)定性心絞痛等疾病時多用氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注方式給藥[13-14]。這樣確實延長了藥效持續(xù)時間，因為按照統(tǒng)計矩理論恒速靜滴時MRT靜滴=MRT靜注+T/2(式中T為輸液時間)[15]。

3.5TOC的分子機制探討 TOC給心肌細胞帶來的益處毋庸置疑，雖然目前關于其作用分子機制研究較少。有研究表明TOC可以抑制磷酸二酯酶4(PDE4)的活性[16-17]。由于PDE4參與細胞環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的調節(jié)過程，因此PDE4與血小板聚集活化、免疫性炎癥反應、血管平滑肌細胞增殖、血管舒張及心肌收縮調節(jié)等過程有關。又有研究表明[2]氧化樟腦注射液能升高大鼠心肌組織中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(iNOS)活性，對內皮功能具有較明顯保護作用，這可能是其改善心肌缺血癥狀、避免心肌纖維化發(fā)生的又一機制。硝酸甘油治療充血性心衰的機制就是通過釋放NO，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使平滑肌和其他組織內的環(huán)鳥甘酸(cGMP)增多，導致肌球蛋白去磷酸化，調節(jié)平滑肌收縮狀態(tài)，而引起血管擴張的。另外，硝酸甘油舌下給藥后，t1/2為1～4 min，作用持續(xù)時間卻達10～30 min。至于TOC是否像硝酸甘油一樣能夠產生活性較弱但半衰期更長的活性代謝產物，仍需要進一步研究。

綜上，對本文建立的GC-MS測定大鼠血漿中的反式氧化樟腦分析方法進行了系統(tǒng)的方法學驗證，結果表明本分析方法可靠，能夠快速、準確地測定大鼠血漿中TOC的濃度，可為TOC的人體內藥代動力學研究提供參考，進而指導臨床合理用藥。