焦宏偉

[海南省干部療養(yǎng)院(海南省老年病醫(yī)院)疼痛康復(fù)科，?？?571100]

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種與肥胖高度相關(guān)的代謝性疾病，長期的血糖增高會對心、腦、血管、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等帶來嚴重損傷，甚至威脅到患者的生命[1-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，50%以上的T2DM合并有非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，NAFLD會促進胰島素抵抗，導(dǎo)致病情進一步加重[4-5]。

芍藥色素是一種天然水溶性植物色素，屬多酚類化合物，是花青素的一種。自然界中有數(shù)百種花青素，普遍具有抗炎、抗氧化等多種生物活性[6-7]。研究表明，黑豆種皮中提取的花青素能夠降低T2DM小鼠的血糖和血脂水平[8]，紫玉米中提取的花青素能夠促進胰島素分泌和加快肝臟對葡萄糖的吸收[9]。芍藥色素對T2DM合并NAFLD的作用，筆者目前未見報道。

本實驗研究了芍藥色素對T2DM合并NAFLD小鼠的保護作用，并初步探討了其作用機制，以期能為T2DM合并NAFLD的治療尋找到更多天然的藥物。

1 材料與方法

1.1實驗動物 本研究采用的無特定病原體(SPF)級的C57BL/6雄性小鼠(8周齡)，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，使用許可證號：SYXK(瓊)2012-0013。小鼠體質(zhì)量20～25 g。所有實驗用小鼠在實驗前先正常喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度在20～25 ℃，相對濕度50%±5%，每12小時交替明暗光照。所有小鼠均自由飲水與進食。

1.2試劑 實驗用芍藥色素采用氯化芍藥色素-3-O-半乳糖(peonidin-3-galactoside，分子式C22H23ClO11，以下簡稱芍藥色素，純度>97%，批號：GY1195AF01)購自上?；菡\生物科技有限公司；小鼠胰島素檢測試劑盒(批號：PI602)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號：032318180609)、超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(批號：040418180613)、增強化學(xué)發(fā)光試劑(批號：101617171013)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(批號：A0208)均購自上海碧云天生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(批號：M180424-102a)、白細胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒(批號：M170912-004a)購自欣博盛生物科技有限公司；p-p65抗體(批號：16)、p-IkB抗體(批號：18)、β-actin抗體(批號：17)購自美國Cell Signaling Technology公司；高脂飼料按照基礎(chǔ)飼料82%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽酸鈉0.5%，蔗糖5%的比例自配。

1.3實驗方法

1.3.1動物建模及分組 參考文獻[10-11]，使用鏈脲佐菌素加高脂飼料建立T2DM合并NAFLD動物模型。48只C57BL/6小鼠，按數(shù)字表法隨機選取8只作為正常對照組，給予普通飼料；其余40只小鼠喂食高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4周，之后腹腔注射使用檸檬酸鹽溶液配制的鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1)溶液，正常對照組小鼠注射等體積檸檬酸鹽。3 d后高脂喂養(yǎng)小鼠靜脈采血檢測空腹血糖，若連續(xù)3 d空腹血糖大于11.1 mmol·L-1說明T2DM建模成功。繼續(xù)給予高脂飼料至第8周末，建T2DM合并NAFLD模型小鼠。按照隨機數(shù)字表法抽取建模成功小鼠，每8只為一組，分成模型對照組及芍藥色素大劑量組、中劑量組、小劑量組，每天分別給予劑量為400，200，100 mg·kg-1芍藥色素(蒸餾水溶解)灌胃，模型對照組及空白對照組用同體積的蒸餾水灌胃，繼續(xù)給藥6周后空腹采集小鼠血清，留取肝組織用于檢測。

1.3.2血清生化檢測 小鼠禁食12 h后眼球采血取血清，使用全自動生化分析儀，檢測樣本血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平。使用胰島素檢測試劑盒，檢測小鼠血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平。

1.3.3炎癥因子水平檢測 使用ELISA試劑盒，檢測血清中TNF-α、 IL-6水平。血清樣本稀釋后加入反應(yīng)孔，加入抗體37 ℃孵育1 h。洗滌后，加入100 μL辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素溶液，避光25 ℃下孵育30 min，洗滌后加入TMB溶液孵育20 min，之后加入終止液。檢測450 nm處的吸光度，與標準品對比，計算TNF-α、IL-6的濃度。

1.3.4氧化應(yīng)激水平檢測 取小鼠肝組織加0.9%氯化鈉溶液制備肝組織勻漿，使用ELISA試劑盒，檢測肝組織勻漿中MDA、SOD的含量。

1.3.5肝組織病理學(xué)變化 取小鼠肝組織標本置于4%多聚甲醛中固定，使用石蠟包埋并切片。使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，通過400倍光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.3.6Western blotting檢測蛋白表達 提取小鼠肝組織蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品在濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜。之后加入5%脫脂奶粉封閉靜置2 h，加入一抗后于4 ℃下過夜，加入二抗繼續(xù)孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色成像。

2 實驗結(jié)果

2.1一般情況對比 正常對照組小鼠活動狀態(tài)好，進食及飲水情況正常，皮毛光澤整潔；模型對照組小鼠活動度明顯減少，進食及飲水均增加，尿量增多、皮毛凌亂無光澤；芍藥色素大劑量組、中劑量組、小劑量組各組小鼠的一般情況，與模型對照組比較，均有不同程度的改善。在注射鏈脲佐菌素4周后，模型對照組小鼠體質(zhì)量增加不明顯，但與正常對照組比較，體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.93，P<0.05)；芍藥色素組小鼠的體質(zhì)量較模型對照組降低(P<0.05)，大劑量組降低最明顯(t=5.98，P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.2血清生化學(xué)指標比較 如表1，與正常對照組對比，模型對照組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST、FBG、FINS水平上升(t=32.29，32.53，44.07，39.59，46.23，10.31，P<0.05)，與模型對照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠血清中相應(yīng)生化指標均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中大劑量組下降最明顯(t=21.28，18.93，31.42，29.07，34.56，6.89，P<0.05)。

2.3血清炎癥因子水平比較 如表2，與正常對照組對比，模型對照組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平顯著升高(t=50.44，34.32，P<0.05)；與模型對照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中高劑量組下降最明顯(t=43.48，22.76，P<0.05)。

2.4肝組織氧化應(yīng)激水平比較 如表3，與正常對照組比較，模型對照組肝組織勻漿中MDA水平升高(t=12.58，P<0.05)，SOD水平下降(t=22.32，P<0.05)；與模型對照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠肝組織勻漿中MDA水平均明顯下調(diào)、SOD水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中大劑量組差異最明顯(t=7.63，18.21，P<0.05)。

2.5肝組織病理學(xué)改變 如圖1，在顯微鏡下觀察小鼠肝組織HE染色切片，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤；模型對照組小鼠肝組織可見彌漫性肝細胞脂肪變性且有大量炎癥細胞浸潤；與模型對照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤均有不同程度地減輕，其中大劑量組改善最顯著。

2.6肝組織NF-κB蛋白活化水平 如圖2，模型對照組肝組織代表NF-κB活性水平的p-p65、p-IkB蛋白表達水平與正常對照組比較明顯上調(diào)，芍藥色素組相應(yīng)蛋白表達水平與模型對照組比較明顯下調(diào)。

3 討論

T2DM與NAFLD高度相關(guān)[12-13]，T2DM可進一步引發(fā)NAFLD，而NAFLD也會誘導(dǎo)T2DM的發(fā)生[14]。這與T2DM可引起胰島素抵抗促進肝臟脂質(zhì)沉積，過量脂質(zhì)沉積加劇脂質(zhì)氧化又可促進胰島素抵抗有關(guān)。T2DM與NAFLD之間的相互作用，會導(dǎo)致疾病進一步加重，威脅生命健康[15]。

T2DM合并NAFLD的發(fā)病機制目前還沒完全明確，已有研究表明糖毒性、脂毒性及其引發(fā)的慢性炎癥是其重要發(fā)病機制[16]。肝臟是脂肪代謝的主要場所，過量脂肪的代謝會產(chǎn)生過量的氧自由基，氧自由基引起細胞脂質(zhì)過氧化，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子浸潤，持續(xù)的炎癥進一步會誘發(fā)胰島素抵抗，從而導(dǎo)致T2DM合并NAFLD疾病進展[17]。因此抗炎、抗氧化是治療T2DM合并NAFLD的重要途徑。

芍藥色素是花青素中的一種，是常用的食品添加劑?；ㄇ嗨仡惢衔锲毡榫哂锌寡?、抗氧化的作用[18-19]。本研究中給予芍藥色素干預(yù)的小鼠，血清中TNF-α、IL-6、MOD水平明顯下降，SOD水平上升，結(jié)果表明芍藥色素對T2DM合并NAFLD小鼠有抗炎、抗氧化的作用。生化學(xué)指標檢測顯示，芍藥色素干預(yù)后，小鼠血清中TC、TG、ALT、AST水平顯著下降。小鼠肝組織HE染色結(jié)果顯示肝細胞脂肪變性以及炎癥細胞浸潤顯著減少，以上結(jié)果提示芍藥色素對T2DM合并NAFLD小鼠具有保護作用。

NF-κB是機體中調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6等炎癥因子的重要轉(zhuǎn)錄因子，p65是NF-κB蛋白重要的亞型，磷酸化IkB激活NF-κB，從而使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，草莓和桔梗中提取的花青素，能夠通過NF-κB通路來抑制小鼠的炎癥[22]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥色素能夠下調(diào)T2DM合并NAFLD小鼠肝組織中p-IkB、p-p65的表達。提示芍藥色素可能通過NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。

表1 5組小鼠體質(zhì)量及血清生化指標

組別體質(zhì)量/gTCTGFBG(mmol·L-1)ALTAST(U·L-1)FINS/(mU·L-1)正常對照組24.26±0.851.348±0.2131.215±0.1876.872±0.52626.427±4.56235.764±5.25912.457±1.036模型對照組28.85±1.18①6.351±0.383①5.126±0.284①18.326±0.463①215.295±11.231①184.672±9.247①21.879±2.367①芍藥色素 小劑量組26.95±1.29②4.264±0.227②3.569±0.246②13.245±0.387②95.478±5.893②87.882±6.721②17.478±1.875② 中劑量組26.37±1.56②3.112±0.217②2.958±0.273②12.458±0.318②81.342±6.775②75.354±5.732②15.578±1.679② 大劑量組25.23±1.24②2.876±0.258②2.536±0.263②11.182±0.357②76.788±5.421②66.544±6.825②15.268±1.327②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

表2 5組小鼠血清炎癥因子水平

組別TNF-αIL-6正常對照組42.471±4.56824.513±3.376模型對照組235.665±9.823①125.788±7.633①芍藥色素 小劑量組82.364±5.679②68.385±5.234② 中劑量組75.324±4.236②58.572±4.281② 大劑量組71.677±4.163②53.321±4.782②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

表3 5組小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平

組別MDA/(μmol·g-1)SOD/(U·mg-1)正常對照組0.657±0.086203.451±9.245模型對照組2.135±0.321①115.267±6.274①芍藥色素 小劑量組1.467±0.224②128.356±3.679② 中劑量組1.235±0.189②142.379±4.127② 大劑量組1.187±0.143②164.587±4.398②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

圖1 5組小鼠肝組織HE染色(×400)

①與模型對照組比較，P<0.01。

圖2 5組小鼠NF-κB蛋白活化水平

①Compared with model control group，P<0.01.

Fig.2TheproteinexpressionofNF-κBinfivegroupsofmice

綜上所述，芍藥色素對T2DM合并NAFLD小鼠具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和胰島素的作用，進一步研究提示芍藥色素可能是通過NF-κB通路來發(fā)揮抗炎作用的。雖然目前的研究未能明確芍藥色素介導(dǎo)NF-κB通路的具體機制，但表明芍藥色素可能是治療T2DM合并NAFLD的一個潛在的藥物，作為常用的食品添加劑，芍藥色素在飲食和健康領(lǐng)域可以發(fā)揮更大的作用。