倪嵐，徐旭林，呂青，郭蓮軍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 武漢 430030)

蝙蝠葛(Menispermum dauricum，DC)，又名北豆根，為防己科藥用植物蝙蝠葛的藤莖，廣泛分布在我國(guó)東北、華北、華東等地。DC在我國(guó)很早就被用于治療心腦血管疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，從DC根莖提取的有效成分如蝙蝠葛酚性堿、蝙蝠葛蘇林堿等具有抑制L型鈣通道、抗血小板聚集[1]、降壓、抗心律失常和抗腦缺血等作用[2]。蝙蝠葛諾林堿(Daurinoline)是一種從蝙蝠葛根莖中分離提取的單體物質(zhì)，前期研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛諾林堿對(duì)家兔頸內(nèi)動(dòng)脈及基底動(dòng)脈平滑肌具有明顯的舒張作用[3-4]，對(duì)小鼠軟腦膜微循環(huán)障礙亦有良好的改善[5]。然而，蝙蝠葛諾林堿對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌損傷是否具有保護(hù)作用，筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此筆者設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，采用原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，通過(guò)氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation，OGD)再灌注的方法來(lái)模擬腦缺血再灌損傷，觀察缺血再灌后蝙蝠葛諾林堿對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用。并進(jìn)一步觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位(mitoehondrial membrane potential，MMP)的改變來(lái)探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3 d齡的Sprague & Dawley(SD)乳鼠，清潔級(jí)，合格證號(hào)：00020736，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)20150007。動(dòng)物房自然采光，室溫(25±1) ℃，相對(duì)濕度(50±10)%。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 蝙蝠葛諾林堿(淡黃色粉末，純度>95%，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系提供)臨用前用稀鹽酸配成0.1，1，10 μg·mL-1的濃度，過(guò)濾除菌，于4 ℃避光保存，備用；連二亞硫酸鈉(批號(hào)：07032)購(gòu)自南京化學(xué)試劑一廠；細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑胎牛血清(批號(hào)：1587602)購(gòu)自Gibco公司，-20 ℃保存；NeurobasalTMMedium(批號(hào)：1551304)、B27(批號(hào)：1769984)均購(gòu)自Gibco公司；胰酶(trypsin，批號(hào)：J150009)購(gòu)自HyClone公司，L-多聚賴氨酸(P1399)，阿糖胞苷(批號(hào)：w10562)均購(gòu)自Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。MTT檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C0009)、ROS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033)和線粒體膜電位試劑盒(批號(hào)：C2006)均購(gòu)自碧云天有限公司(江蘇，中國(guó))。流式用磷酸鹽緩沖液(10XPBS，g·L-1：NaCl 80.0，KCl 2.0，Na2HPO4·12H2O 36.3，KH2PO42.4，pH值7.2-7.4)，用前稀釋至1倍使用。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 311型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；IX-71型倒置相差顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS公司)；ELX8全自動(dòng)酶標(biāo)儀(德國(guó)Biotek儀器公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取1～3 d齡的SD乳鼠，75%乙醇消毒后，斷頭并迅速剝離出全腦，取腦后仔細(xì)分離出大腦皮層，用D-Hanks液清洗后剪成組織塊約1 mm3，加入等體積0.25%胰蛋白酶37 ℃消化15 min。DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素)終止消化后將組織塊吹打成細(xì)胞懸液，200目不銹鋼篩選網(wǎng)過(guò)濾，2000×g離心10 min，棄上清液，在細(xì)胞沉淀中加入DMEM/F12培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，通過(guò)顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105·mL-1，接種在預(yù)先用0.1%多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿內(nèi)，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液成Neurobasal培養(yǎng)液(含10% B27，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素)，第3天加入阿糖胞苷(20 μmol·L-1)作用24 h抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。以后隔天換液，直到相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)束[6]。

1.4.2OGD模型制備與實(shí)驗(yàn)分組 取培養(yǎng)8 d的皮層神經(jīng)元，利用拆信封法隨機(jī)分為正常對(duì)照組；模型對(duì)照組；蝙蝠葛諾林堿(0.1，1，10 μg·mL-1)預(yù)處理組，每組 6孔(n=6)，重復(fù)3次。蝙蝠葛諾林堿在OGD前24 h給予。上述各組孵育24 h后，正常組加入200 μL含糖的Earle’s液，模型對(duì)照組和給藥組加入2 mmol· L-1連二亞硫酸鈉的無(wú)糖Earle’s液，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃，5% CO2，95% O2)孵育4 h后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)[7-8]。

1.4.3噻唑藍(lán)(MTT)測(cè)定細(xì)胞存活率 OGD結(jié)束后，向接種細(xì)胞的96孔板中加入MTT(5 g·L-1，每孔200 μL)，培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2，95%O2)孵育4 h。孵育結(jié)束后將上清液去除，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，氣浴震蕩儀震蕩10 min使深藍(lán)色甲臜充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(測(cè)定組A570-測(cè)定空白A570)/(正常組A570-測(cè)定空白A570)×100%。

1.4.4細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定 應(yīng)用二氯二氫熒光素二乙酯(2，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)熒光探針進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè)。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)的脂酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，進(jìn)而使探針負(fù)載于細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)ROS氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF的熒光可用于反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。細(xì)胞按“1.4.1”項(xiàng)操作處理后，加入稀釋好的10 μmol·L-1DCFH-DA，37 ℃孵育30 min后，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。DCF的熒光強(qiáng)度利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以正常組為100% 進(jìn)行換算[9]。

1.4.5細(xì)胞內(nèi)MMP的測(cè)定[10]培養(yǎng)細(xì)胞加入適當(dāng)體積的JC-1工作液，37 ℃孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，以充分去除細(xì)胞外的JC-1，然后加入JC-1緩沖液0.3 mL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。JC-1單體激發(fā)光490 nm，發(fā)射光530 nm；JC-1聚合物激發(fā)光525 nm，發(fā)射光590 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以正常組為100%進(jìn)行換算。

2 結(jié)果

2.1蝙蝠葛諾林堿對(duì)培養(yǎng)皮層細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：正常組神經(jīng)元胞體飽滿，邊緣光滑，有較強(qiáng)折光性；損傷組神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體膨脹甚至破裂，細(xì)胞膜不完整，折光性差，給藥后這種情況明顯改善，見(jiàn)圖1。

2.2蝙蝠葛諾林堿對(duì)培養(yǎng)皮層元細(xì)胞存活率MTT實(shí)驗(yàn)的影響 正常對(duì)照組的神經(jīng)元百分存活率為(100±29.12)%，模型對(duì)照組神經(jīng)元百分存活率為(54.11±6.62)%，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)元的百分存活率明顯降低(P<0.05)；蝙蝠葛諾林堿小劑量處理組神經(jīng)元的百分存活率為(67.53±10.54)%，與模型對(duì)照組比較存活率明顯升高(P<0.05)；中劑量處理組的細(xì)胞存活率為(71.50±9.79)%，與模型對(duì)照組比較存活率明顯升高(P<0.05)；大劑量處理組的細(xì)胞存活率為(87.48±5.29)%，與模型對(duì)照組比較存活率明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3蝙蝠葛諾林堿對(duì)OGD-R引起細(xì)胞內(nèi)ROS增加的影響 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，經(jīng)OGD-R處理的細(xì)胞，胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度顯著增高，而蝙蝠葛諾林堿處理后，胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度明顯降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與OGD模型對(duì)照組比較，1和10 μg·mL-1的蝙蝠葛諾林堿降低細(xì)胞內(nèi)ROS比例高達(dá)230.09%和354.05%(P<0.05)，而低濃度(0.1 μg·mL-1)蝙蝠葛諾林堿對(duì)OGD誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS無(wú)顯著性影響，見(jiàn)圖3。

2.4蝙蝠葛諾林堿對(duì)OGD-R引起MMP下降的影響 蝙蝠葛諾林堿顯著降低OGD-R所致的線粒體膜去極化程度，表現(xiàn)為紅色熒光增強(qiáng)，綠色熒光減弱。與模型對(duì)照組比較，蝙蝠葛諾林堿(1，10 μg·mL-1)分別降低MMP為24.66%和37.88%(P<0.05)，而低濃度(0.1 μg·mL-1)作用不明顯，見(jiàn)圖4。

3 討論

腦缺血再灌注損傷與ROS的過(guò)量產(chǎn)生密切相關(guān)，其發(fā)生過(guò)程包括：DNA的氧化損傷后易導(dǎo)致基因突變或細(xì)胞死亡；蛋白質(zhì)中與功能有關(guān)的氨基酸成分對(duì)自由基或脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物特別敏感，使酶活性、生物膜和細(xì)胞的功能、代謝發(fā)生異常變化，膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜在內(nèi)的所有膜性結(jié)構(gòu)細(xì)胞器受損，而引起相應(yīng)功能障礙[11]。本研究通過(guò)利用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元缺血缺氧損傷后ROS含量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD模型中神經(jīng)元細(xì)胞ROS含量明顯增加，而蝙蝠葛諾林堿劑量依賴性減低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提示蝙蝠葛諾林堿對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，可能與減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。

A.正常對(duì)照組；B.OGD組；C.蝙蝠葛諾林堿(0.1 μg·mL-1)組；D.蝙蝠葛諾林堿(1 μg·mL-1)組；E.蝙蝠葛諾林堿(10 μg·mL-1)組。

圖1 5組神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化(×250)

A.normal control group；B.OGD group；C.daurinoline(0.1 μg·mL-1)group；D.daurinoline(1 μg·mL-1)group；E.daurinoline(10 μg·mL-1)group.

Fig.1Morphologicalchangesofneuronsinfivegroups(×250)

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

線粒體是神經(jīng)元凋亡信號(hào)的中心中轉(zhuǎn)站和能量轉(zhuǎn)換場(chǎng)所，產(chǎn)生三磷酸腺苷為細(xì)胞提供能量。另一方面線粒體產(chǎn)生的活性氧簇介導(dǎo)分子信號(hào)，觸發(fā)急性凋亡激活物的釋放，也是細(xì)胞死亡通路的整合元件。在腦缺血再灌注損傷中，很多因素如胞質(zhì)及線粒體基質(zhì)Ca2+超載、氧化應(yīng)激過(guò)度、能量耗竭、誘導(dǎo)凋亡的Bcl-2家族蛋白等均可促進(jìn)線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transitionpore，MPTP)不可逆過(guò)度開(kāi)放[12]，導(dǎo)致線粒體跨膜電位崩解，呼吸鏈解耦聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，線粒體腫脹，外膜破裂，最終導(dǎo)致依賴Cyt-c和caspase途徑的細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠原代培養(yǎng)皮層細(xì)胞OGD損傷后，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生增多，線粒體跨膜電位降低。蝙蝠葛諾林堿可劑量依賴性穩(wěn)定線粒體膜電位。

綜上所述，在原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞OGD-R模型中，蝙蝠葛諾林堿通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，穩(wěn)定線粒體膜電位，保護(hù)線粒體的功能，從而發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。