程姝敏,張 凱,諶 通,畢研貞,劉銅軍,孔令斌,唐慧昕,王全義,洪 豐*,舒振鋒

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院,山東 濟(jì)寧272000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院；5.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；6.上海美峰生物技術(shù)有限公司)

CDX(cell-line-derived xenograft)模型是將人腫瘤細(xì)胞系接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)構(gòu)建的模型[1]，此模型均是以裸鼠、NSG小鼠等為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有人腫瘤細(xì)胞遺傳、分子、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面的特征，能反映人腫瘤遺傳多樣性[2,3]，但因?yàn)槿鄙僬Ｃ庖呦到y(tǒng)，難以確切、真實(shí)地反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展與患者免疫功能變化之間的內(nèi)在聯(lián)系。此實(shí)驗(yàn)借助新型微載體材料，在具有正常免疫系統(tǒng)C57BL/6小鼠背部種植人源性結(jié)腸癌細(xì)胞，同樣方法種植于NSG小鼠背部，通過比較兩種小鼠的成瘤情況及腫瘤病理特點(diǎn)等，探討具有正常免疫功能C57BL/6小鼠人結(jié)腸癌移植瘤模型構(gòu)建及其意義。此模型的成功構(gòu)建為揭示結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制和研制抗結(jié)腸癌新藥提供了更合適的模型。

1 材料與方法

1.1 微載體、細(xì)胞系

微載體：新型微載體microcarrier 6是由美國 ELYON BIOTECHNOLOGIES LLC公司提供的具有低免疫原性、生物兼融性等特點(diǎn)的多孔支架(圖1 A)[4]。細(xì)胞系：人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于由Sigma公司生產(chǎn)的RPMI-1640 DMEM和10%國產(chǎn)胎牛血清的完全培養(yǎng)液(圖1 B)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠20只，6-8周齡，22-25 g體質(zhì)量，雄性小鼠；NSG小鼠20只,6-8周齡，22-25 g體質(zhì)量，雄性小鼠，均購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。飼養(yǎng)于無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，整個(gè)試驗(yàn)過程均符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)指南的要求。

1.3 C57BL/6、NSG小鼠人結(jié)腸癌模型的分組及建立將C57BL/6、NSG小鼠分別按移植物的不同分為細(xì)胞對(duì)照組、細(xì)胞-微載體復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組，每組各10只。C57BL/6、NSG小鼠均按照以下要求接種于背部皮下：對(duì)照組每只小鼠接種含2×107個(gè)/mL HCT116細(xì)胞PBS液100 μl；實(shí)驗(yàn)組每只小鼠接種含2×107個(gè)/mL HCT116細(xì)胞和20 μg微載體的復(fù)合物懸液100 μl。細(xì)胞-微載體復(fù)合物(圖1 C)是由對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)胞與處理修飾后的微載體混合而成，調(diào)整細(xì)胞及微載體濃度后，為使微載體內(nèi)細(xì)胞達(dá)到飽和，放于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 C57BL/6、NSG小鼠腫瘤生長觀察指標(biāo)皮下注射移植物后每日觀察小鼠的食欲、活動(dòng)度及體質(zhì)量變化，記錄成瘤時(shí)間、瘤體大小和成瘤率[5]。接種后4周處死荷瘤小鼠，常規(guī)解剖，記錄腫瘤的體積、質(zhì)地、浸潤以及壞死程度。移植瘤病理組織行常規(guī)HE染色、免疫組化染色，一抗CDX-2、CEA均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

圖1 A新型微載體microcarrier 6(100×)；B人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞(200×)；C細(xì)胞-微載體復(fù)合物(200×)

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6、NSG小鼠生存及腫瘤生長情況

2.1.1C57BL/6小鼠生存及腫瘤生長情況 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)組小鼠于13天開始，食欲、活動(dòng)度較前減少，體質(zhì)量較前增加；對(duì)照組小鼠食欲、活動(dòng)度，體質(zhì)量較前無顯著性差異。

實(shí)驗(yàn)組C57BL/6小鼠共接種10只，8只成瘤，成瘤率達(dá)80%(圖2 A)。接種的第7-9天，背部可觸及腫瘤，13-17天肉眼可見背部皮下隆起腫塊，生長迅速，4周時(shí)，腫塊體積約0.6-1.1 cm3，生長曲線見圖3。形態(tài)相對(duì)規(guī)整，圓形或橢圓形，紅白相間，表面可見新生血管。對(duì)照組C57BL/6小鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未成瘤。

2.1.2NSG小鼠生存及腫瘤生長情況 實(shí)驗(yàn)組NSG小鼠10只，無死亡；細(xì)胞對(duì)照組NSG小鼠10只，死亡1只。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠均于5天開始，食欲、活動(dòng)度較前減少，體質(zhì)量較前增加。

實(shí)驗(yàn)組NSG小鼠9只成瘤，成瘤率達(dá)90%(圖2 B)；對(duì)照組共接種10只，死亡1只未成瘤，余均成瘤，成瘤率達(dá)90%。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組均于接種的第5-7天，背部可觸及腫瘤。10-15天肉眼可見背部皮下隆起腫塊，生長迅速，4周時(shí)，腫塊體積約0.8-1.3 cm3，生長曲線見圖3，形態(tài)相對(duì)規(guī)整，圓形或橢圓形，紅白相間，表面可見新生血管。

2.2 C57BL/6、NSG小鼠病理組織學(xué)檢查

C57BL/6、NSG小鼠病理組織學(xué)均表現(xiàn)為：移植瘤包膜完整，易與周圍組織分離，形態(tài)多樣，以橢圓形為主，表面見新生血管網(wǎng)(圖2 C)。光鏡下可見大量核大深染的異型性細(xì)胞雜亂排列，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，核仁明顯，核分裂像增多，并向周圍組織浸潤生長，腫瘤邊緣見新生血管生成，中央偶見壞死(圖4A、4B)。實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)偶見未被清除的少量殘余微載體(圖4 C)。

圖2 A C57BL/6荷瘤小鼠；B NSG荷瘤小鼠；C 移植瘤

圖3 移植瘤生長曲線

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

免疫組化染色示CDX-2、CEA均為陽性表達(dá)(圖5A、5B)，染色結(jié)果判定：陽性顆粒定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為(+)，證實(shí)異型細(xì)胞為人源性結(jié)腸癌細(xì)胞(圖5)。

圖4 移植瘤HE染色 A移植瘤(100×)；B移植瘤(200×)；C移植瘤(200×)箭頭：殘余微載體。

圖5 移植瘤免疫組化染色(200×) A：CDX-2；B：CEA

3 討論

目前國內(nèi)外常用于研究腫瘤的動(dòng)物模型有CDX模型和人源腫瘤異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型[6]。這些模型均采用免疫缺陷小鼠，其中NSG小鼠為免疫缺陷程度最高的小鼠，對(duì)異源性細(xì)胞幾乎沒有排斥反應(yīng)，是最適合異源性移植的工具鼠[7]。然而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫力密切相關(guān)，該模型鼠缺少免疫系統(tǒng)，不能闡明腫瘤形成過程中與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互影響，也無法篩選一些通過免疫功能激活的抗腫瘤藥物。

該實(shí)驗(yàn)借助一種新型微載體—microcarrier6，成功構(gòu)建了以正常免疫小鼠為動(dòng)物模型的人結(jié)腸癌移植瘤模型，彌補(bǔ)了因免疫缺陷小鼠缺乏免疫細(xì)胞而不能準(zhǔn)確模擬機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫攻擊等重要缺點(diǎn)。microcarrier6具備低免疫源性，可減小不同種屬間免疫相關(guān)沖突，大量腫瘤細(xì)胞以微載體為支架，聚集并快速生長，經(jīng)膠原蛋白和SDF-1a修飾后，有利于新生血管深入微載體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，為腫瘤的生長提供足夠的營養(yǎng)[8，9]。該實(shí)驗(yàn)中，C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)組成瘤率可達(dá)80%，對(duì)照組均未成瘤，提示微載體具有屏障作用，能減少免疫系統(tǒng)對(duì)異源性結(jié)腸癌細(xì)胞的直接殺傷及/或排斥作用。同樣將結(jié)腸癌細(xì)胞系種植于NSG小鼠，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均成瘤，成瘤率達(dá)90%，鏡下病理除實(shí)驗(yàn)組偶有殘余微載體，其余結(jié)果兩組均一致，表明在免疫系統(tǒng)缺陷的情況下，無論是否存在microcarrier6，結(jié)腸癌細(xì)胞系均可在NSG小鼠移植部位成瘤。C57BL/6小鼠與NSG小鼠相比，雖然成瘤速度慢，但鏡下病理組織均表現(xiàn)為大量核大深染的異型腫瘤細(xì)胞雜亂排列，并向周圍組織浸潤生長，腫瘤邊緣見新生血管生成，中央偶見壞死。免疫組化示CDX-2、CEA均為陽性表達(dá)，證實(shí)異型細(xì)胞為人源性結(jié)腸癌細(xì)胞。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)借助新型材料—微載體，成功構(gòu)建了正常免疫小鼠的結(jié)腸癌移植瘤模型，此方法成瘤率高、操作簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，為研究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制和臨床抗腫瘤藥物篩選，尤其是免疫抗腫瘤藥篩選以及抗結(jié)腸癌新藥的研發(fā)提供了新的更理想的動(dòng)物移植瘤模型。