高 華，張 靜，周忠涵，劉麗秋

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病科，山東 青島266003)

Klotho基因是于1997年被發(fā)現(xiàn)的一種“抗衰老”基因，表達(dá)在多種組織，如腎臟、甲狀旁腺、腦、卵巢、胰腺等，腎臟(主要是腎小管上皮細(xì)胞)和腦脈絡(luò)膜為其高表達(dá)部位[1]。Klotho基因編碼的klotho蛋白(KL)有膜型及分泌型兩種形式，膜型KL(mKlotho)是I型跨膜蛋白，主要作為纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)的協(xié)同受體發(fā)揮鈣磷代謝調(diào)節(jié)作用[2]；分泌型KL(sKlotho)可以在血液及體液中被檢測到，其除了具有mKlotho的鈣磷調(diào)節(jié)作用外，還具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化及抑制血管鈣化等多種保護(hù)功能[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示腎臟klotho基因表達(dá)的下調(diào)在血管緊張素II(Ang II)誘導(dǎo)的腎臟損害中起重要作用[4]。Ang II受體拮抗劑(ARB)可以阻斷Ang II與AT1受體結(jié)合從而阻止血管收縮，減少血管加壓素和醛固酮釋放，減少腎臟水鈉重吸收，減緩心臟血管、腎臟細(xì)胞的生長，但其在減少尿蛋白、延緩腎病進(jìn)程的作用及具體機(jī)制方面的研究較少。奧美沙坦酯是臨床中常用的ARB類藥物，本研究將阿霉素腎病模型大鼠作為研究對象，探討奧美沙坦酯對阿霉素腎病大鼠KL表達(dá)及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1一般材料 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠35只,體質(zhì)量240±12 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào) SCXK(京)2016G006,飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。

1.1.2儀器試劑 鹽酸阿霉素(MedChemExpress),奧美沙坦酯[第一三共制藥(上海)有限公司],兔抗鼠anti-klotho多克隆抗體(英國Abcam),β-actin(北京 博奧森),Trizol試劑(美國Invitrogen),cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒(北京 Takara)，免疫組化試劑盒(北京 中杉金橋),DAB顯色試劑盒(福州 邁新),蘇木精-伊紅染色試劑(北京 索萊寶),Olympus AU640日立全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1阿霉素腎病模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組(25只)和正常對照組(NC組)(10只)。模型組給予一次性尾靜脈注射阿霉素6.5 mg/kg造模,對照組大鼠注射等體積的生理鹽水。存活的大鼠造模1周后放入代謝籠留取24 h尿，測定尿蛋白含量。模型組24 h尿蛋白>100 mg/24 h，提示造模成功。共有22只大鼠造模成功，隨機(jī)將模型組分為阿霉素腎病組(ADR組)、奧美沙坦酯干預(yù)組(OLM組)，每組11只。

1.2.2給藥方法 造模成功后，OLM組每日給予奧美沙坦酯10 mg/(kg·d)灌胃[5]，NC組與ADR組每日給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃連續(xù)8周，每周稱重1次，調(diào)整藥物用量。試驗(yàn)期間各組大鼠分籠喂養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

1.2.3標(biāo)本的制備 連續(xù)灌胃8周后，各組大鼠放入代謝籠，留取24 h尿液，測定尿蛋白含量。標(biāo)本的收集過程中及時(shí)清理黏附在代謝籠內(nèi)壁的食物殘?jiān)痛笫蠹S便，以排除其對尿蛋白定量測定的影響。用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，下腔靜脈取鮮血3-5 ml，3 000 r/min離心10 min后取血清移入EP管中，-20℃保存；同時(shí)取出雙側(cè)腎臟組織，左側(cè)腎臟由液氮冷藏快速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，留作West blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR),右側(cè)腎臟組織放入10%中性甲醛轉(zhuǎn)移至4℃冰箱保存，用于蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4一般項(xiàng)目的檢測 觀察各組大鼠精神狀態(tài)、攝食、大小便、體型等。全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠24 h尿蛋白、血清白蛋白、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、肌酐水平，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5Klotho mRNA、KL、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的測定 取-80℃冰箱保存的左側(cè)腎組織，采用q-PCR檢測KL mRNA的表達(dá)；Western blot檢測KL的含量，用ImageJ軟件分析KL的相對表達(dá)量；采用羥胺法檢測大鼠腎組織中SOD活性,比色法檢測MDA含量。以上檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.6組織病理學(xué)觀察 取4℃冰箱保存的右側(cè)腎組織，包埋制成3 μm石蠟切片，切片脫蠟、復(fù)水后經(jīng)蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片,光鏡下觀察腎小球和腎小管間質(zhì)形態(tài)學(xué)改變。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模后NC組精神狀態(tài)、飲食、大小便、體重等生長發(fā)育情況良好；ADR組及OLM組逐漸出現(xiàn)精神萎靡、脫毛、體重減少、陰囊水腫等癥狀，ADR組較OLM組癥狀明顯，至第8周，ADR組大鼠死亡2只。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白及血清生化指標(biāo)測定

與NC組相比，ADR組、OLM組24 hUPr、TC、TG明顯升高，ALB明顯降低，且ADR組差別更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三組間BUN、SCr水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。

2.3 各組大鼠KL mRNA、KL表達(dá)和氧化應(yīng)激因子水平

如圖2所示，與NC 組相比，ADR組、OLM組大鼠腎組織中KL mRNA的表達(dá)和SOD活性明顯降低，MDA水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與ADR組相比，OLM組大鼠腎組織中KL mRNA的表達(dá)和SOD活性明顯升高，MDA水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot(圖3)顯示：ADR組及OLM組腎組織KL表達(dá)均低于NC組，但OLM組KL表達(dá)高于ADR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠24 h尿蛋白、血清生化指標(biāo)水平

圖2 各組大鼠KL mRNA表達(dá)、SOD活性及MOD水平

圖3 各組大鼠大鼠腎組織KL的表達(dá)量

2.4 24hUPr與KL表達(dá)、SOD活性、MDA水平的相關(guān)性

24hUPr與KL水平呈負(fù)相關(guān)(r=-9728,P<0.0001)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9766.P<0.0001),與 MDA含量呈正相關(guān)(r=0.9322,P<0.0001) (見圖4)。

2.5 各組大鼠腎臟形態(tài)變化

如圖5，HE染色結(jié)果顯示，NC組腎小球、間質(zhì)形態(tài)基本正常；ADR組可見球囊粘連，伴系膜區(qū)擴(kuò)大、基質(zhì)增生，腎小球硬化明顯，腎小管上皮細(xì)胞明顯萎縮,可見空泡及顆粒變性,腎小管內(nèi)可見蛋白管型,間質(zhì)血管腫脹明顯，間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤；OLM組大鼠腎小球病理改變較ADR組明顯減輕。

3 討論

阿霉素腎病模型大鼠的病理改變類似于人類局灶節(jié)段性硬化(FSGS)引起的慢性進(jìn)展性腎臟病[6]，臨床上主要表現(xiàn)為持續(xù)性大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥、水腫及腹水等，是目前公認(rèn)的能較好模擬人類慢性腎臟病的動(dòng)物模型，被廣泛應(yīng)用于研究慢性腎病潛在的機(jī)制及治療策略[7]。

Aizawa等[8]報(bào)道在慢性腎病中，腎臟klotho基因的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，這提示KL可能是作為一種腎臟的保護(hù)性因子，參與了延緩慢性腎病的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)中，ADR組及OLM組大鼠與NC組相比，KL表達(dá)量明顯降低，24hUPr、TC、TG明顯升高，腎小球、間質(zhì)病變明顯，OLM組較ADR組上述改變明顯減輕，這與Aizawa的研究結(jié)果相一致，KL確實(shí)可以延緩腎病的進(jìn)展。多項(xiàng)國內(nèi)外研究顯示，KL對腎臟的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①調(diào)節(jié)鈣磷代謝：近年來有研究表明,FGF-23/KL軸在慢性腎臟病礦物質(zhì)與骨代謝中起著關(guān)鍵的作用,FGF-23通過KL發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。②抗氧化應(yīng)激：關(guān)于KL抑制氧化應(yīng)激的研究發(fā)現(xiàn)，sKlotho能夠通過增強(qiáng)SOD的表達(dá)，減少ROS的產(chǎn)生，從而抑制氧化應(yīng)激。也有研究[10]指出，胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/insu1in-like growth factor-1,IG-1)調(diào)控的FoxO蛋白是KL的靶點(diǎn)之一。有動(dòng)物研究結(jié)果表明，KL-FoxO-SOD-ROS是腎臟內(nèi)抗氧化應(yīng)激的信號(hào)機(jī)制[11]。本實(shí)驗(yàn)中，OLM組大鼠較ADR組KL表達(dá)、SOD活性明顯升高，MDA明顯降低，提示KL能夠增強(qiáng)SOD的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激，與已有相關(guān)研究結(jié)果相同，但其是通過KL-FoxO-SOD-ROS途徑，抑或通過其他尚未發(fā)現(xiàn)的途徑，發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激作用，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。③抗炎癥反應(yīng)：Zeng等[12]的研究證實(shí)，在衰老導(dǎo)致的腎臟損傷和炎癥反應(yīng)中，高表達(dá)的KL能夠通過調(diào)控RIG-I/NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)抗炎作用。④抗凋亡作用：在急性腎損傷的動(dòng)物模型研究中顯示，給予外源性的sKlotho，能夠顯著抑制腎小球細(xì)胞的凋亡，這一作用可能是通過增強(qiáng)熱休克蛋白70(Hsp70)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[13]。⑤抗纖維化：國內(nèi)學(xué)者證實(shí)補(bǔ)充外源性KL或上調(diào)KL的表達(dá)可以顯著延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。研究表明KL可能通過影響MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表達(dá)而調(diào)控ECM降解過程，也可能通過抑制TGF-β1與其II型受體的結(jié)合，抑制TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]，進(jìn)而減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。KL還可以抑制Wnt/β-catenin[15]、ERK1/2-p38[16]激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制腎組織纖維化。⑥抑制血管鈣化：KL通過加強(qiáng)FGF-23活性促進(jìn)腎臟對磷的排泄，調(diào)節(jié)磷代謝，延緩血管鈣化的發(fā)生[17]；體外實(shí)驗(yàn)證明，KL也可以直接抑制磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，阻礙血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[18]。

圖4 24hUPr與KL表達(dá)、SOD活性、MDA水平的相關(guān)性

圖5 各組大鼠腎臟HE染色(×400)

目前KL水平降低的原因尚不完全清楚，可能與氧化應(yīng)激損失、微炎癥狀態(tài)、鈣磷代謝紊亂、Ang II的作用及血管內(nèi)皮功能紊亂等有關(guān)。Ishizaka等[19]認(rèn)為Ang II介導(dǎo)了KL的表達(dá)下調(diào)，且該作用是Ang II 1型受體依賴性的。奧美沙坦酯是一種新型的ARB類藥物，通過選擇性阻斷Ang II與血管平滑肌AT l受體的結(jié)合而阻斷Ang II，口服后在小腸內(nèi)完全去酯轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物奧美沙坦，不需經(jīng)過肝細(xì)胞色素CYP-450酶代謝。奧美沙坦可以與AT1受體的2個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，一個(gè)是-OH組，另一個(gè)是-COOH組，即所謂的“雙鏈占領(lǐng)”，而其他的ARB類其他藥物只能與AT1的-OH組結(jié)合[20,21]。奧美沙坦酯高度選擇性決定了其與AT1受體的高親和力和持久穩(wěn)定的作用，因其獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于臨床。研究表明,腎臟RAAS的過度激活與許多腎臟疾病有關(guān),RAAS過度激活的主要效應(yīng)包括氧化應(yīng)激、NF-κB激活、纖維母細(xì)胞增殖等[22]。OLM組較ADR組24hUPr、TC、TG水平明顯降低，且腎臟病理改變明顯減輕，證實(shí)奧美沙坦酯可以降低尿蛋白，減緩大鼠腎臟損害進(jìn)展。有研究[5，23]顯示，ARB類藥物可提高大鼠KL的表達(dá),抑制氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)中，OLM組大鼠較ADR組KL表達(dá)上調(diào)，SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯減弱。綜上，OLM很可能是通過上調(diào)KL的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激，從而延緩腎病的進(jìn)展。

眾多研究[24]顯示，在慢性腎臟病的早期即可檢測到KL的降低，而且隨著腎功能不全的進(jìn)展，其降低趨勢也越發(fā)明顯。KL的減少在一定程度上反映了CKD患者腎臟損傷的程度，有可能作為腎功能損傷的血清學(xué)標(biāo)志物。同時(shí)，KL的減少在一定程度上促進(jìn)了慢性腎臟病患者病情進(jìn)展，有可能成為CKD患者預(yù)測腎功能惡化的標(biāo)志物之一。關(guān)于KL延緩腎臟疾病進(jìn)展的具體機(jī)制、通路研究極其重要，奧美沙坦酯如何上調(diào)KL表達(dá)，改善腎臟功能的具體機(jī)制目前尚不明確，還需進(jìn)一步的研究。