李姝玉 楊詩帆 洪嶺

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種免疫紊亂引起的自身免疫性疾病，常引起多器官損傷。目前臨床只能使用會(huì)引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)的激素類和免疫抑制劑類藥物治療SLE，探尋SLE的特效藥物是科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。作為傳統(tǒng)中藥的代表，青蒿素在治療和控制瘧疾上效果顯著，為世界人民的健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。近來研究發(fā)現(xiàn)青蒿素對SLE的治療也具有一定的效果。青蒿素類衍生物可以抑制SLE小鼠產(chǎn)生自身抗體、減輕組織損傷并延長SLE小鼠的生命[2]。DNA甲基化在SLE發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，低甲基化狀態(tài)可誘導(dǎo)SLE發(fā)病或加重。N6-腺嘌呤（m6A）甲基化是真核生物中最廣泛的一種化學(xué)修飾[3]。m6A甲基化修飾主要位于外顯子的終止密碼子及3′-UTRs附近區(qū)域[4-5]。m6A甲基化修飾可影響mRNA的剪接、出核、穩(wěn)定性和翻譯等RNA代謝過程，并且經(jīng)過甲基化修飾后的mRNA可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。m6A甲基化修飾的可逆調(diào)控和發(fā)揮其生物學(xué)功能需要甲基化轉(zhuǎn)移酶（METTL3）、去甲基化修飾酶（ALKBH5和 FTO）以及特異性的識別甲基化位點(diǎn)蛋白（TLR7和TLR9）的參與。基于此，本研究采用實(shí)驗(yàn)室研究的方法，探討雙氫青蒿素是否通過影響SLE小鼠巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平發(fā)揮治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SPF級雌性MRL/lpr SLE小鼠20只，購自上海南方模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。DMSO和雙氫青蒿素（純度98%）購自美國Sigma公司；Antimouse METTL3、Anti-mouse ALKBH5、Anti-mouse FTO、Anti-mouse TLR7、Anti-mouse TLR9 和 Anti-mouse β-Actin均購自于美國Abcam公司；m6A（202003）抗體購自德國Synaptic Systems公司。DMEM和FBS均購自美國PAA公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞的分離 具體參照文獻(xiàn)[6]。將3%脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基2ml注入小鼠腹腔，3～4d后將小鼠以頸椎脫臼法處死；處死后的小鼠以75%乙醇溶液浸泡5min，取出小鼠，腹面朝上，用鑷子撕開皮膚，完全暴露腹膜；然后用20ml注射器往腹腔注入10ml無血清培養(yǎng)基，針尖朝上，避開腸道和脂肪，從不同方向反復(fù)抽洗腹腔液，重復(fù)此步驟2次，將收集的腹腔液置于50ml的離心管；細(xì)胞懸液以1 200 r/min離心5min，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞懸液鋪入6孔培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)1h后用預(yù)熱培養(yǎng)基洗1次，留下貼壁細(xì)胞即為新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。以上細(xì)胞均在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中維持生長，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平檢測 采用Dot Blot法。將雙氫青蒿素稀釋到培養(yǎng)基中至終濃度分別為 20、40、60μmol/L，分別培養(yǎng)巨噬細(xì)胞 72h，設(shè)為觀察組；另采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72h，設(shè)為對照組。兩組巨噬細(xì)胞均用Trizol試劑提取總RNA，然后用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）磁珠純化獲得mRNA；將各組1μg mRNA滴加到PVDF膜上，紫外線交聯(lián)后用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST緩沖液封閉2h，加入用封閉液稀釋后的m6A抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；然后加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶的兔二抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，最后用ECL法顯影。用ImageJ軟件對曝光圖片進(jìn)行灰度分析，將對照組的灰度定義為1，觀察組做相對應(yīng)的均一化處理，得出甲基化水平數(shù)據(jù)。

1.2.3 巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO、TLR7、TLR9 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。兩組巨噬細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說明書進(jìn)行。用PBS洗2次細(xì)胞，按1×107個(gè)細(xì)胞加入1ml Trizol試劑抽提；加入0.2ml氯仿震蕩混勻，室溫靜置3 min后4℃14 000 r/min離心15min；吸取上層水相置于新管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，室溫靜置10min后再離心30 min棄上清液，沉淀以75%乙醇溶液洗滌1次后空氣干燥；RNA溶解于40μl DEPC水中，用Nanodrop分光光度計(jì)（美國賽默飛公司）進(jìn)行濃度和純度測定后保存于-80℃。取 2μg細(xì)胞總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）說明書逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，于 42℃孵育30min，反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)99℃滅活5 min后加入80μl雙蒸水稀釋混勻，作PCR反應(yīng)的模板。采用SYBRGreen熒光定量PCR混合試劑（日本TOYOBO公司）進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μl）：2×SYBR Premix Ex TaqTM（10μl），上游引物（10μmol/L，1.0μl），下游引物（10μmol/L，1.0μl），模板 cDNA（8.0μl）。反應(yīng)條件：95（3min）；40 個(gè)循環(huán)（95℃，15s）；60℃，40s（收集熒光）。mRNA 相對表達(dá)水平是以β-Actin做參照，即每次定量PCR的Ct值減去對應(yīng)樣品中β-Actin的Ct值，樣品擴(kuò)增的倍數(shù)變化計(jì)算采用2-ΔΔCt法。溶解曲線分析確認(rèn)定量PCR引物擴(kuò)增的特異性。引物序列如下：ALKBH5 F：5′-CGCGGTCATCAACGACTACC-3′，R：5′-ATGGGCTTGAACTGGAACTTG-3′；METTL3 F：5′-CTGGGCACTTGGATTTAAGGAA-3′，R：5′-TGAGAGGTGGTGTAGCAACTT-3′；FTO F：5′TTCATGCTGGATGACCTCAATG-3′，R：5′-GCCAACTGACAGCGTTCTAAG-3′；TLR7 F：5′-ATGTGGACACGGAAGAGACAA-3′，R：5′-GGTAAGGGTAAGATTGGTGGTG-3′；TLR9 F：5′-ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT-3′，R：5′-GAGGCTTCAGCTCACAGGG-3′；HPRT F：5′-TCAGTCAACGGGGGACATAAA-3′，R：5′-GGGGCTGTACTGCTTAACCAG-3′；β-Actin F：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，R：5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′。

1.2.4 巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO、TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。將兩組巨噬細(xì)胞均用PBS洗1遍；在細(xì)胞裂解液中加入適量雞尾酒（cocktail）蛋白酶抑制劑和苯甲基硫酰氟（PMSF），混勻加入到待收的細(xì)胞中，冰上孵育5min后，刮下細(xì)胞并置于離心管中4℃震蕩，以最大轉(zhuǎn)速4℃離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入6×上樣緩沖液，100℃煮5 min，制備好的樣品于-20℃保存?zhèn)溆?。?0μg總蛋白進(jìn)行電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%BSA的TBST封閉2h，加入用封閉液稀釋后的待測蛋白的抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶的相應(yīng)二抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，最后用ECL法顯影[6-7]。用ImageJ軟件對曝光后的灰度圖片進(jìn)行灰度分析，將對照組的灰度定義為1，觀察組做相對應(yīng)的均一化處理，得出蛋白表達(dá)水平數(shù)據(jù)。

1.2.5 巨噬細(xì)胞TLR7和TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平檢測 采用m6A-qRT-PCR法。實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[8-9]。兩組巨噬細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說明書進(jìn)行?？俁NA先用多聚Poly（A）選擇純化mRNA（FastTrack MAG micro mRNA分離試劑盒，美國Invitrogen公司），但mRNA不隨機(jī)打斷片段化，以便于用oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。然后按照m6A免疫共沉淀和測序的實(shí)驗(yàn)操作，但不構(gòu)建cDNA文庫。為比較m6A豐度的變化，相對富集首先做歸一化處理，然后再在m6A免疫沉淀的樣品數(shù)據(jù)之間進(jìn)行比較。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較觀察組與對照組巨噬細(xì)胞（1）mRNA m6A 甲基化修飾水平；（2）METTL3、ALKBH5和 FTO mRNA 表達(dá)水平；（3）METTL3、ALKBH5 和 FTO蛋白表達(dá)水平；（4）TLR7和TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平；（5）TLR7和TLR9蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均由獨(dú)立的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平比較 與對照組比較，觀察組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平比較Dot Blot圖

2.2 兩組巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO mRNA表達(dá)水平比較 見表1。

表1 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTOmRNA表達(dá)水平比較

由表1可見，與對照組比較，雙氫青蒿素處理后觀察組巨噬細(xì)胞METTL3 mRNA表達(dá)下調(diào)，而ALKBH5、Fto mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且雙氫青蒿素處理濃度越高，METTL3 mRNA表達(dá)水平越低，ALKBH5 mRNA表達(dá)水平越高，而FTO mRNA表達(dá)水平對濃度不敏感。

2.3 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTO蛋白表達(dá)水平比較 見圖2。

圖2 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTO蛋白表達(dá)水平比較電泳圖

由圖2可見，與對照組比較，雙氫青蒿素（40、60μmol/L）處理后觀察組巨噬細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)下調(diào)，而ALKBH5蛋白表達(dá)上調(diào)，對FTO蛋白表達(dá)幾乎沒有影響；且雙氫青蒿素濃度越高，METTL3蛋白表達(dá)水平越低，ALKBH5蛋白表達(dá)水平越高。

2.4 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平比較 見表2。

表2 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平比較

由表2可見，與對照組比較，用60μmol/L雙氫青蒿素處理后，觀察組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平明顯下調(diào)。

2.5 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平比較見圖3。

圖3 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平比較電泳圖

由圖3可見，與對照組比較，用60μmol/L雙氫青蒿素處理后，觀察組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。

3 討論

SLE是一種發(fā)生于多器官、以病情反復(fù)為特征的自身免疫性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的細(xì)胞凋亡異常以及B、T淋巴細(xì)胞活化閾值的改變，導(dǎo)致自我耐受能力下降和自身抗體的過量產(chǎn)生，隨后誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致多個(gè)組織器官的損傷[10]。METTL3是m6A甲基化過程中關(guān)鍵的甲基化酶，其酶活性和表達(dá)與m6A甲基化修飾水平呈正相關(guān)，ALKBH5和FTO是重要的m6A去甲基化修飾蛋白[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在SLE小鼠的巨噬細(xì)胞中，60μmol/L的雙氫青蒿素能通過抑制METTL3的mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)ALKBH5和FTO的表達(dá)，進(jìn)而從巨噬細(xì)胞整體水平上抑制mRNA m6A的甲基化修飾水平，但雙氫青蒿素如何調(diào)控METTL3、ALKBH5和FTO表達(dá)的機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。

屠呦呦團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素治療SLE的一期臨床療效顯著，且無明顯不良反應(yīng)。天然免疫系統(tǒng)在SLE的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，特別是Toll樣受體，其異常表達(dá)或過度激活均可能導(dǎo)致SLE的發(fā)病[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者的外周血中Ⅰ型干擾素濃度偏高[14-15]。雙氫青蒿素可能通過抑制TLR4/IRF/IFN信號通路，從而抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)，進(jìn)而對SLE小鼠發(fā)揮治療作用。青蒿素及其類似物的抗炎作用是通過抑制TLR受體和關(guān)鍵炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括核因子κB（NF-κB）、STAT1和增殖蛋白激酶（MAPK）等[14-15]。TLR7和TLR9這兩個(gè)核酸受體能感受細(xì)胞內(nèi)和外的核酸，進(jìn)而觸發(fā)下游的炎癥信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)用60μmol/L雙氫青蒿素處理巨噬細(xì)胞后能明顯的降低TLR7和TLR9上的m6A甲基化修飾水平，進(jìn)而抑制TLR7和TLR9蛋白的表達(dá)，從而緩解巨噬細(xì)胞TLR7和TLR9表達(dá)異常所觸發(fā)的炎癥，減緩SLE的癥狀。本研究主要是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了雙氫青蒿素對SLE小鼠的治療作用，在小鼠體內(nèi)探討雙氫青蒿素生物學(xué)作用將是接下來的研究方向。

綜上所述，雙氫青蒿素可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平抑制TLR7和TLR9蛋白表達(dá)的機(jī)制發(fā)揮治療SLE的作用。