李杰，熊禮杭，嚴(yán)潔

（1永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425100；2.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南 永州 425100）

0 引言

有研究發(fā)現(xiàn)，重組Tipα蛋白（rTipα）經(jīng)激活NF-kB會誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生分泌IL-1β以及IL-6細(xì)胞因子。而IL-1β以及IL-6細(xì)胞因子在THP-1細(xì)胞中的生產(chǎn)與分泌均與激活酶半胱天冬酶-1（Caspase-1）活化相關(guān)，Caspase-1活化過程受胞漿內(nèi)多蛋白復(fù)合體NLRP3炎性小體的調(diào)控[1]。本研究以探討幽門螺桿菌Tipα蛋白經(jīng)激活NF-kB對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)機(jī)制。探究幽門螺桿菌持續(xù)性感染以及對導(dǎo)致發(fā)生胃黏膜炎癥反應(yīng)機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

菌株選擇E.coli BL21菌株，載體選擇pET-30a（+），THP-1細(xì)胞、H.pylori-26695標(biāo)準(zhǔn)株為本研究保存樣本。選用細(xì)菌基因組提取試劑盒及配套試劑，DNA快速純化試劑盒及配套試劑，BCA蛋白濃度檢測試劑盒及配套試劑，高純質(zhì)粒小提取試劑盒及配套試劑，康為世紀(jì)公司生產(chǎn)ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒及配套試劑，廈門市鱟試劑實驗廠生產(chǎn)去內(nèi)毒素試劑盒，欣博盛生物科技有限公司生產(chǎn)人TNF-α、人IL-1β以及人IL-6的ELISA檢測試劑盒及配套試劑。

1.2 主要試劑

Tipα蛋白目的基因引物；康為公司生產(chǎn)Supper DNA Marker，Dye公司生產(chǎn)2×Es Taq MasterMix；Thermo公司生產(chǎn)Barn-HI限制性內(nèi)切酶、Xho-I限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶；鼠抗His、兔抗β-actin、兔抗Caspase-1、羊抗鼠IgG（+）HRP、羊抗兔IgG（+）HRP以及兔抗NLRP3 p20亞單位抗體；10%濃度胎牛血清；碧云天生物公司生產(chǎn)PDTC；Fermentas公司生產(chǎn)蛋白預(yù)染Mark-er、RI-PA緩沖液、LPS、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、多黏菌素B、兩性霉素B、萬古霉素以及三甲氧芐氨嘧啶（TMP）[2]。

1.3 對Tipα重組蛋白的鑒定及純化處理

將Tipα重組蛋白置于1 mmol/L濃度的IPTG，于30℃溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 h，經(jīng)Western Blot對表達(dá)結(jié)果進(jìn)行鑒定，通過His純化樹脂對重組蛋白進(jìn)行去內(nèi)毒素純化處理。

1.4 對THP-1的細(xì)胞培養(yǎng)及建立模型

應(yīng)用胎牛血清制作RPMI-1640培養(yǎng)基，對THP-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且通過PMA誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞。分別用0-200 μg/mL的Tipα重組純化蛋白激活細(xì)胞，設(shè)置200 ng/mL的LPS作為陽性結(jié)果對照組、設(shè)置PBS作為陰性結(jié)果對照組，對每組均設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中分別培養(yǎng)0-24 h，取各孔的上清液進(jìn)行試驗

1.5 ELISA法與Western Blot檢測

ELISA法檢測TNF-α、IL-1β以及IL-6等 炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，對預(yù)處理前后的Tipα誘導(dǎo)細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測對比，通過Western Blot法對NLRP3、Caspase-1分子表達(dá)水平進(jìn)行檢測。ELISA法與Western Blot檢測依據(jù)各檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行規(guī)范操作[3]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

不同濃度Tipα蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞在24 h時的TNF-α、IL-1β以及IL-6表達(dá)水平不同。隨Tipα蛋白濃度提高，TNF-α、IL-1β以及IL-6表達(dá)水平也相應(yīng)提高，當(dāng)Tipα含量增加至200μg/ mL時，尚未有明顯細(xì)胞毒性出現(xiàn)，見表1。

3 討論

表1 不同濃度Tipα蛋白誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β以及IL-6表達(dá)水平

本研究通過分子克隆技術(shù)，以Hp基因組DNA作模板，對 Tipα基因的原核表達(dá)載體pET30a-Tipα進(jìn)行構(gòu)建，再經(jīng)PCR、位點酶切以及基因測序后驗證插入Tipα基因的序列與Genebank的基因序列相符，確保純化所得到蛋白是Tipα蛋白[4-6]。而在蛋白的提純及純化過程當(dāng)中，菌內(nèi)毒素污染是常見的問題，尤其對于巨噬細(xì)胞而言，即使是極低劑量的內(nèi)毒素都可即可促使其分泌出高水平炎癥因子，導(dǎo)致蛋白的自身作用被掩飾。在本研究中，對純化后蛋白進(jìn)行去內(nèi)毒素處理。對細(xì)胞因子的分泌水平進(jìn)行檢測時，也采通過多黏菌素B作為對照。研究提示多黏菌素B對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α產(chǎn)生顯著抑制作用（P＜0.05）。對于Tipα誘導(dǎo)所產(chǎn)生TNF-α則無明顯的影響（P＞0.05）。為驗證Tipα蛋白對誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子能力，本研究以不同劑量的經(jīng)去內(nèi)毒素處理Tipα蛋白刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞，通過ELISA法檢測，在30-200μg/mL濃度范圍內(nèi)，Tipα蛋白濃度提高，TNF-α、IL-1β以及IL-6表達(dá)水平也相應(yīng)提高，當(dāng)Tipα含量增加至200μg/mL時，尚未有明顯細(xì)胞毒性出現(xiàn)。研究提示，Tipα蛋白可在一定程度上起到誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生并分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6。

綜上所述，研究初步表明Tipα蛋白經(jīng)激活NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎癥因子。