朱玉可,徐子龍,何逸凡,周昌旻,沈夢迪,王璐瑤,李 靜,張小鳳,2
(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;2.組織與移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽 蚌埠 233004)
克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一種,近年來在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。CD的主要病理學(xué)改變?yōu)榉翘禺愋?、肉芽腫性炎癥,病變可累及口腔至肛管整個(gè)消化道,但主要以回腸和結(jié)腸為主。雖然手術(shù)可以切除病變腸管但仍無法治愈該病,患者仍然面臨術(shù)后復(fù)發(fā)的問題。采用藥物誘導(dǎo)緩解和維持緩解仍是CD的主要治療方式。然而遺憾的是,當(dāng)前針對CD治療的藥物均存在一定程度不足,更為安全、有效的藥物亟待開發(fā)。氯喹(Chloroquine,CQ)是一種經(jīng)典的抗瘧原蟲藥物,但新近的報(bào)道顯示CQ還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[2],且已被證實(shí)對多種免疫相關(guān)性疾病有治療作用,例如:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、艾滋病(AIDS)等。CD也是一種免疫相關(guān)性疾病,而CQ在CD領(lǐng)域的研究還并不充分。本研究采用IL-10-/-小鼠作為CD動(dòng)物模型[3],觀察CQ對CD樣腸炎的作用效果及可能機(jī)制,重點(diǎn)探討對小鼠腸黏膜免疫及腸屏障功能的影響,以期為CD的藥物治療提供參考。
1.1 材料選取15周齡雄性IL-10-/-小鼠及野生型小鼠(wild type,WT),飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境(組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),體重為(28~32)g,環(huán)境溫度為(23±2)℃,小鼠自由飲水,常規(guī)飼料喂養(yǎng)。CQ、異硫氰酸(FITC)-葡聚糖購于Sigma Chemicals公司(St. Louis, MO, USA);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)及酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于R&D公司(Emeryville,CA,USA);Claudin、Occludin、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3及β-actin一抗夠買于R&D公司(Emeryville、CA、USA)。
1.2 干預(yù)方法15周齡IL-10-/-小鼠隨機(jī)分為氯喹治療組(CQ組,n=8)和模型組(Model組,n=8)。CQ組干預(yù)方法:單次給藥劑量為100mg/kg體質(zhì)量,藥物溶于0.2mL生理鹽水中,灌胃給藥,1次/d[4];Model組每日給予0.2mL生理鹽水灌胃。另取8只WT小鼠作為正常對照,僅用于證實(shí)IL-10-/-小鼠自發(fā)性腸炎的存在。干預(yù)4周后處死小鼠并進(jìn)行相關(guān)的檢測分析。
1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法
1.3.1 評估CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠腸道炎癥的影響 (1)腸炎組織學(xué)評分:小鼠結(jié)腸組織經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并參考Spencer推薦的炎癥評分(inflammatory score)[5],對兩組小鼠結(jié)腸組織的炎癥程度進(jìn)行評估,每張切片選取三個(gè)不同的視野分別評分,評分量為0分~4分,炎癥越重評分越高,最后取平均數(shù)作為最終的評分結(jié)果。(2)檢測兩組小鼠結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)水平:采用ELISA檢測小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6以及TGF-β的含量,具體操作參照ELISA試劑盒說明書。
1.3.2 流式細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn) 分離小鼠腸系膜淋巴結(jié),置于5mL 1640培養(yǎng)基中,用玻璃勻漿器研磨,PBS洗一遍,200目濾網(wǎng)過濾掉組織,分離出的單個(gè)核細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),取2×106個(gè)細(xì)胞接種于48孔板中,加細(xì)胞刺激劑及BFA孵育6h,收集細(xì)胞進(jìn)行表面染色及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,檢測Th1(CD3+、CD4+、IFN-γ+)、Th17(CD3+、CD4+、IL-17A+)、Treg(CD4+、CD25+、Foxp3+)細(xì)胞比例,并用FlowJo-V10軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
1.3.3 腸通透性檢測實(shí)驗(yàn) 小鼠禁食4h后,用大分子物質(zhì)FITC-葡聚糖分別對兩組小鼠進(jìn)行灌胃處理,劑量為600mg/kg,待4h后通過頸椎脫臼的方法處死小鼠并從心臟抽取1mL血液,室溫下放置1h后分離血清分光光度計(jì)(490nm)檢測血清中FITC含量。
1.3.4 免疫熒光檢測實(shí)驗(yàn) 組織切片脫蠟水化后,使用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)(高壓10min),置于室溫中冷卻。去離子水室溫條件下孵育20min,除去內(nèi)源性過氧化物酶。封閉用山羊血清工作液覆蓋于組織面上,37℃溫箱孵育20min后倒去血清,勿洗。滴加一抗工作液(兔單克隆Claudin抗體及兔單克隆Occludin抗體,稀釋濃度1∶200)覆蓋于組織表面,4℃過夜。熒光二抗覆蓋于組織表面(山羊抗兔IgG H&L,稀釋濃度1∶200),37℃溫箱孵育45min(避光)。在黑暗條件下吸棄二抗 (不再?zèng)_洗),加入DAPI染液(2.5μg/mL),室溫孵育20min,在黑暗條件下使用抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.3.5 Western blot檢測實(shí)驗(yàn) 提取胞漿及核蛋白,經(jīng)Bradford定量,煮沸變性后,每孔加入35μg蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,再加入Claudin、Occludin、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和β-actin一抗稀釋液(1∶1000),放置在4℃搖床,12h后滴加二抗,洗膜,滴加ECL顯影液,即可對結(jié)果進(jìn)行分析。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 23.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示計(jì)量資料,組間的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有顯著性。
2.1 CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠腸道炎癥的影響如圖1所示,正常WT小鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)完好,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤;Model組小鼠結(jié)腸黏膜見大量炎癥細(xì)胞浸潤,部分區(qū)域融合成團(tuán)(圖1A黑色箭頭處);CQ組小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。CQ組小鼠結(jié)腸組織炎癥評分顯著低于Model組(P<0.05);促炎因子TNF-α和IL-6水平顯著低于Model組(P<0.05),抗炎因子TGF-β水平顯著高于Model組(P<0.05)。
圖1 CQ干預(yù)對克羅恩病模型小鼠腸道炎癥的影響
注:A為小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×200);B為小鼠結(jié)腸炎癥評分的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較;C為小鼠腸系膜淋巴結(jié)炎癥介質(zhì)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。vs Model組,aP<0.05
2.2 CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠腸黏膜免疫反應(yīng)的影響
如圖2所示:CQ組小鼠的Th1、Th17細(xì)胞比例顯著低于Model組(P<0.05),Treg細(xì)胞比例顯著高于Model組(P<0.05)。
圖2 CQ干預(yù)對克羅恩病模型小鼠免疫系統(tǒng)的影響
注:A和B為兩組小鼠Th1細(xì)胞含量的比較;C和D為兩組小鼠Th17細(xì)胞含量的比較;E和F為兩組小鼠Treg細(xì)胞含量的比較。vs Model組,aP<0.05
2.3 CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠腸屏障功能的影響
如圖3所示:CQ組小鼠腸黏膜對FITC-葡聚糖的通透性較Model組顯著降低(P<0.05)。
圖3 CQ干預(yù)對克羅恩病模型小鼠腸黏膜屏障通透性的影響
注: vs Model組,aP<0.05
2.4 CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠腸黏屏障結(jié)構(gòu)的影響
如圖4所示:CQ組小鼠腸粘膜細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin和Occludin的蛋白表達(dá)量顯著高于Model組(P<0.05)。
2.5 CQ干預(yù)對IL-10-/-小鼠JAK2/STST3信號通路的影響如圖5所示:CQ組小鼠腸黏膜JAK2/STAT3的磷酸化水平顯著低于Model組(P<0.05)。
圖4 CQ干預(yù)對克羅恩病模型小鼠腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的影響
注:A和B為兩組小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin和Occludin的表達(dá)情況;C為兩組小結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin的Western blot半定量檢測結(jié)果;D為兩組小鼠結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 vs Model組,aP<0.05
圖5 CQ干預(yù)對克羅恩病模型小鼠腸黏膜信號通路的影響
注:A為兩組小鼠的腸黏膜JAK2/STAT3 信號通路蛋白的Western blot半定量檢測結(jié)果;B為兩組小鼠的腸黏膜JAK2/STAT3 信號通路蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。vs Model組,aP<0.05
既往,CD主要見于歐美高加索人種,但近年來包括我國在內(nèi)的亞洲地區(qū)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[6],而與患者日漸增多形成反差的是相對落后的診療水平。當(dāng)前,在我國提高CD的治療效果具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。雖然CD的發(fā)病機(jī)制并不明確,但腸黏膜免疫異常及腸屏障功能受損是最受認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制假說之一。圍繞這一靶點(diǎn)進(jìn)行藥物治療探索,有望為CD治療提供新的選擇。鑒于CQ的抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能,我們嘗試分析其是否對CD這種免疫性腸炎具有療效,并進(jìn)一步分析可能的機(jī)制。
本研究選用IL-10-/-小鼠作為CD的動(dòng)物模型。該品系小鼠在SPF級環(huán)境中,飼養(yǎng)至第15周時(shí)可形成穩(wěn)定的、持續(xù)性的結(jié)腸炎[3]。CQ干預(yù)結(jié)束后,我們分析發(fā)現(xiàn)CQ可顯著抑制IL-10-/-小鼠結(jié)腸炎癥,黏膜中促炎介質(zhì)IL-6和TNF-α水平顯著降低,而抗炎因子TGF-β水平顯著升高,這一組結(jié)果提示CQ對CD樣腸炎具有一定治療效果。CD腸黏膜免疫反應(yīng)類型以Th1、Th17為主,而Treg在免疫炎癥的發(fā)生過程中起抑制作用[7]。通過FCM檢測我們發(fā)現(xiàn)CQ組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th1和Th17的細(xì)胞比例顯著減少,而Treg的細(xì)胞比例顯著升高,這提示CQ具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能。腸屏障受損是CD疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié),因此維持良好的腸屏障功能可有效地控制和緩解CD的病情發(fā)展[8-9]。通透性實(shí)驗(yàn)證明CQ干預(yù)后小鼠的腸屏障功能得到了顯著的改善;IF及Western blot結(jié)果顯示CQ干預(yù)后增加了小鼠腸黏膜緊密連接蛋白Claudin及Occludin的表達(dá)量,這提示CQ干預(yù)后小鼠的腸屏障結(jié)構(gòu)得到了顯著的保護(hù)。JAK2/STAT3是調(diào)控炎癥的關(guān)鍵信號通路,其下游產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)IL-6和TNF-α等具有直接破壞腸黏膜屏障的作用;并可引發(fā)炎癥級聯(lián)放大,誘發(fā)急性炎癥和維持慢性炎癥[10-11],Western blot結(jié)果顯示CQ組p-JAK2和p-STAT3的水平顯著低于Model組,這說明CQ干預(yù)抑制了JAK2和STAT3的磷酸化激活,這可導(dǎo)致IL-6 和TNF-α等促炎介質(zhì)釋放減少,從而減輕對腸黏膜緊密連接蛋白的破壞[12],這提示CQ可能通過抑制JAK2和STAT3的磷酸化激活而發(fā)揮對腸黏膜屏障的保護(hù)作用。
我們的研究結(jié)果具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前CD的常規(guī)治療藥物有氨基水楊酸類,糖皮質(zhì)激素類、免疫調(diào)節(jié)劑類及生物制劑類[13],雖然可選治療藥物種類很多,但仍然存在效果不穩(wěn)定、藥物抵抗以及毒副作用大等問題,臨床上仍要開發(fā)高效、低毒的新藥物以滿足不斷增長的治療需求[14]。
我們的研究存在不足之處:雖然研究選擇的IL-10-/-小鼠為國際公認(rèn)CD動(dòng)物模型[3],但研究設(shè)計(jì)之初并沒有設(shè)置正常對照組以證實(shí)所選擇模型具有自發(fā)性腸炎。本研究僅是增補(bǔ)了正常小鼠結(jié)腸組織HE染色,這雖然可以確定所選擇的CD模型存在自發(fā)性腸炎,但無法證明CQ干預(yù)IL-10-/-小鼠后腸炎改善的程度等情況,我們將在今后的研究中考慮更為全面和深入地評估CQ對腸炎的影響與機(jī)制。
綜上,CQ可通過調(diào)節(jié)腸黏膜免疫反應(yīng)及保護(hù)腸屏障功能發(fā)揮改善CD樣腸炎的作用,其作用機(jī)制可能部分與抑制JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。