張臘梅，李 竹，李子濤，袁 琳，劉建廷，李彩娟

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，雖然早期治療能夠有效降低乳腺癌死亡率，但轉(zhuǎn)移仍是癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1-2]。乳腺癌轉(zhuǎn)移是由多重化學(xué)變化引起的，如組織固有性降低、細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜結(jié)構(gòu)下降，蛋白水解增加等[3]。MMP9的表達(dá)與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]。本研究分析CTX對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步研究CTX對MMP9表達(dá)的影響，為深入研究乳腺癌治療的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料CTX購自于Sigma公司(C0768MSDS)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液、購自于美國hyclone公司；胎牛血清購自于杭州四季青公司；Trizol ReagenT購自于Invitrogen公司；MMP9、β-actin引物由南京abm公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖購自于北京陽光思特生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫資料MMP9基因的表達(dá)數(shù)據(jù)來自GEPIA數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中的腫瘤和正常樣品來自于癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(dá)(GTEx)項(xiàng)目，包含9736種腫瘤樣本和33種癌癥類型。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析MMP9在癌中的表達(dá)差異；Kaplan-Merier數(shù)據(jù)庫分析MMP9與乳腺癌總生存率相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理人乳腺癌細(xì)胞MCF-7受贈(zèng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(細(xì)胞源于美國ATCC細(xì)胞庫)，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于濕度95%、5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%，且狀態(tài)良好，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)CTX濃度設(shè)為1個(gè)對照組(0mmol/L)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)。

1.4 MTT檢測MCF-7細(xì)胞增值活性將MCF-7細(xì)胞按5×103個(gè)細(xì)胞/mL接種于96孔板，每孔100L，設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞鋪滿后，棄去舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)孔加入不同濃度CTX(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對照組，分別培養(yǎng)24h、36h、48h后每孔分別加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔分別加入150μL DMSO，震蕩器震蕩10min。在酶標(biāo)儀上選擇490nm波長測定光密度(OD)值。

1.5 細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后，在6孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS沖洗細(xì)胞表面3次，分別加入含不同濃度CTX的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。對照組給予同等不含藥物的完全培養(yǎng)基。分別在劃痕后0h、24h于顯微鏡下觀察劃痕區(qū)的變化，標(biāo)記并拍照。計(jì)算劃痕愈合率%=[劃痕寬度(初始時(shí)間)-劃痕寬度(檢測時(shí)間)]/劃痕寬度(初始時(shí)間)×100%。

1.6 RT-PCR檢測MMP9基因表達(dá)情況收集4組MCF-7細(xì)胞后，Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，檢測細(xì)胞濃度和純度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。MMP9上游引物5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’,長度22bp；下游引物5’-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3’，長度19bp；β-actin內(nèi)參上游引物5’-GATTCCTATGTGGGCGAC-3’，長度18bp；內(nèi)參下游引物5’-TTGTAGAAGGTGTGGTGCC-3’，長度19bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10min。取5μL PCR終產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因相對表達(dá)量。

1.7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率MCF-7細(xì)胞長滿到90%，胰酶消化細(xì)胞，收集于15 mL離心管，離心5min，加入培養(yǎng)基使細(xì)胞被吹打成細(xì)胞懸液，每孔1mL，接種于鋪有爬片的6孔板內(nèi)，放5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，給予不同濃度CTX，繼續(xù)孵育24h。參照Tunel試劑盒進(jìn)行固定、漂洗、Tunel反應(yīng)液及染色。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗(yàn)，組間比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP9基因表達(dá)規(guī)律及預(yù)后分析MMP9基因在乳腺癌(BRCA)中高表達(dá)，見圖1A。Kaplan-Meier分析表明，MMP9基因高表達(dá)組患者的總體生存率低于MMP9低表達(dá)組，見圖1B。

圖1 MMP9基因表達(dá)和預(yù)后情況

注:圖1A:MMP9在乳腺癌中的表達(dá)情況；圖1B:MMP9高表達(dá)的乳腺癌患者總體生存率低于MMP9低表達(dá)患者

圖2 MTT檢測CTX對MCF-7細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 MTT法篩選出藥物濃度及其對細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與對照組(0mmol/L)相比，CTX(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)處理MCF-7細(xì)胞24h、36h、48h后均能顯著抑制細(xì)胞的增殖水平,且隨著時(shí)間的增加而呈劑量依賴性，見圖2。

2.3 CTX對MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響CTX作用于MCF-7細(xì)胞0h、24h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況。顯微鏡下結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L)的遷移能力隨著藥物劑量的增加而降低，見圖3。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CTX對MCF-7細(xì)胞遷移的影響(×100)

2.4 CTX對MCF-7增殖和凋亡的影響激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率對藥物劑量增加而增加，見圖4。

圖4 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測CTX對MCF-7細(xì)胞增殖凋亡的影響(×100)

2.5 CTX對MMP9mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，MMP9的表達(dá)水平隨著CTX劑量的增加而降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。盡管積極的治療策略和早期發(fā)現(xiàn)方法取得了進(jìn)步，但腫瘤復(fù)發(fā)[5]仍然是乳腺癌患者與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因。通常復(fù)發(fā)的腫瘤通常更具侵襲性，具有高轉(zhuǎn)移潛力，并且會(huì)對其治療產(chǎn)生耐受性，最終導(dǎo)致不良的預(yù)后。因此有效識(shí)別與這些現(xiàn)象相關(guān)的生物學(xué)事件和分子靶標(biāo)將有助于改善治療和預(yù)后[6]。

圖5 RT-PCR檢測CTX對MCF-7細(xì)胞的影響

MMP9常在不同的惡性腫瘤中表達(dá)。許多研究已經(jīng)探索了MMP9作為不同類型癌癥的生物標(biāo)志物。MMP9主要通過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解(例如，I型、II型和IV型膠原)、上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和侵襲而導(dǎo)致多種腫瘤類型的細(xì)胞過程[7]。MMP9表達(dá)的增加與侵襲性表型和乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、鼻咽癌[10]和胃癌[11]預(yù)后不良有關(guān)。MMP9在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)與較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率[12-13]和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[14]以及較差的無復(fù)發(fā)生存率[15-16]有關(guān)。這表明，MMP9的表達(dá)具有腫瘤和組織特異性，可在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的功能?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果提示，乳腺癌中MMP9的表達(dá)明顯高于正常組織中的表達(dá)。與乳腺癌癌旁組織相比，MMP9高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后有著較短的生存率，這與前面一些學(xué)者的研究結(jié)果相一致。為進(jìn)一步闡述CTX在乳腺癌治療中的作用機(jī)制，用不同濃度CTX處理MCF-7細(xì)胞后，采用MTT法、TUNEL法分別檢測MCF-7細(xì)胞生長活性、凋亡。結(jié)果表明，CTX能夠抑制MCF-7細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且隨著藥物劑量的增大，抑制效果加強(qiáng)。這說明CTX在乳腺癌細(xì)胞生長進(jìn)程中，和促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著抑制作用。

致癌的幾個(gè)重要過程，包括侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成與細(xì)胞外微環(huán)境有關(guān)，MMP9降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、改變細(xì)胞間與細(xì)胞外基質(zhì)的連接、裂解細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外環(huán)境，促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移[17-20]，本研究探索了CTX在乳腺癌遷移中的作用，用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞遷移情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的MCF-7遷移細(xì)胞量低于對照組的細(xì)胞量，提示CTX能夠抑制乳腺癌的遷移。通過PCR檢測MMP9mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的MMP9mRNA的表達(dá)低于對照組，提示CTX可以下調(diào)MMP9的表達(dá)水平。因此，我們推測CTX可能通過下調(diào)MMP9，發(fā)揮抑制MCF-7細(xì)胞的遷移的作用。

綜上所述，CTX能夠抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且抑制MMP9基因在乳腺癌中的表達(dá)，改善患者的預(yù)后。但CTX具有一定的毒副作用，在乳腺癌治療中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。