魏思敏，王英輝，唐志書*，蘇 瑞，許洪波，陳 琳，劉世軍，李 琛

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽(yáng) 712083；2長(zhǎng)安大學(xué)理學(xué)院，西安 710064

納米銀材料作為近年來新興的納米材料[1]，因?yàn)槠浼瓤梢钥朔?xì)菌的耐藥性[2]，又對(duì)微生物具有很好的抑制作用、且對(duì)正常細(xì)胞毒性低[3]，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，因此研究納米銀材料的制備方法及理化性質(zhì)具有重要的意義。傳統(tǒng)的制備納米銀材料的方法包括物理法[4]和化學(xué)法[5]；其中物理法對(duì)大型儀器依賴較強(qiáng)，且會(huì)造成高的能量損耗；而化學(xué)法中會(huì)使用大量的有毒化學(xué)試劑，這些特點(diǎn)在一定程度上限制了這兩種制備方法的應(yīng)用范圍。生物制備法[6]主要利用微生物或植物作為還原劑，是一種環(huán)境友好、綠色節(jié)能的制備方法，近年來已在納米材料制備領(lǐng)域被逐漸使用[7,8]。

中藥是一類天然的植物資源，關(guān)于中藥成分分析的研究表明其含有生物堿[9]、糖類[10]、黃酮類化合物[11]等多種活性成分。前期利用植物作為還原劑制備納米材料的研究顯示：生物堿、糖類和黃酮類等化合物會(huì)在制備過程中起到還原劑作用，這一特點(diǎn)為中藥作為還原劑制備納米銀材料提供了先決條件；其次，前期關(guān)于植物法制備納米材料的研究表明，植物中的活性成分會(huì)進(jìn)一步吸附在納米材料的表面起穩(wěn)定作用；因?yàn)橹兴幍纳锵嗳菪暂^好，因此中藥制備得到的納米銀材料更利于其在臨床研究中的應(yīng)用[12]。

大棗又名紅棗，為鼠李科植物棗(ZizyphusjujubaMill)的干燥成熟果，味甘、性溫，有補(bǔ)脾胃、益氣生精、調(diào)和諸藥的功效，還具有補(bǔ)中益氣、緩和藥性、養(yǎng)血安神之功效[13]，在我國(guó)已有幾千年的種植史，其藥用價(jià)值在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《證類本草》中均有記載。大棗的化學(xué)成分中糖類占大棗果肉總干物的80%以上，還原糖占總糖含量的70.8%～95.0%[14]，此外還有蛋白質(zhì)、生物堿、三萜、皂苷、黃酮和環(huán)腺苷酸、環(huán)鳥苷酸以及氨基酸等多種活性成分[15]。因此本文首先利用大棗水提液中豐富的化學(xué)成分作為還原劑和穩(wěn)定劑成功制備了納米銀材料，并探討溶液pH、料液比以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原反應(yīng)效率的影響；隨后通過激光粒度儀以及TEM對(duì)所制得納米銀材料的理化性質(zhì)進(jìn)行了表征并且探討了可能的還原反應(yīng)機(jī)理；最后對(duì)大棗納米銀材料的抗氧化和抗菌活性進(jìn)行了研究。這些結(jié)果不僅可以為納米銀材料的制備提供新的方法，同時(shí)也為大棗的綜合開發(fā)利用提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)，島津(日本)公司；ZEN 3600激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；JEM-2010型透射電子顯微鏡，東京理化株式會(huì)社(日本)；CAP225D電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Zirbus Vaco 5 凍干機(jī)，德國(guó)Zirbus有限公司；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-20B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

硝酸銀(AgNO3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、檸檬酸鈉、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂粉均為分析純，購(gòu)于成都科隆化學(xué)品有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)為分析純，購(gòu)買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用中藥材大棗購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍副教授鑒定為鼠李科植物棗(ZizyphusjujubaMill)的干燥成熟果，符合《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定。供試菌種大腸桿菌(ATCC25922，Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923，Staphylococcusaureus)均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大棗水提液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥大棗藥材5.0 g(粉碎)，加入100 mL純化水超聲提取4 h，過濾得濾液，備用，經(jīng)測(cè)量大棗水提液的pH為5.0。

1.2.2 不同pH大棗水提液與AgNO3的反應(yīng)

取5 mL大棗水提液原液一份，另取四份5 mL大棗水提液，用10 mol/L的NaOH水溶液分別調(diào)節(jié)pH至6.0、7.0、8.0、9.0，向不同pH的大棗水提液中均加入0.01 mol/L的AgNO3溶液5 mL，室溫下超聲反應(yīng)。因?yàn)榧{米銀在紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)410 nm附近有特征的吸收，所以在合成過程中使用UV-Vis光譜監(jiān)測(cè)納米銀材料的生成。

1.2.3 不同料液比時(shí)大棗水提液與AgNO3的反應(yīng)

確定最佳pH之后，考察不同料液比對(duì)于反應(yīng)的影響，控制大棗水提液與硝酸銀用量比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5，室溫下超聲反應(yīng)，過程中通過使用UV-Vis光譜測(cè)量410 nm附近吸收峰的強(qiáng)度，確定最佳的料液比。

1.2.4 大棗水提液還原制備納米銀材料

取5 mL大棗水提液，調(diào)節(jié)pH至優(yōu)化出來的最適pH，向其中加入0.01 mol/L的AgNO3溶液5 mL，室溫下超聲反應(yīng)，過程中使用紫外-可見光譜監(jiān)測(cè)410 nm附近吸收峰的變化，待反應(yīng)完成后取反應(yīng)懸浮液，9 000 rpm離心30 min，棄上清液取沉淀，用超純水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥至恒重。

1.2.5 化學(xué)還原法制備納米銀材料

取硝酸銀溶于超純水，加入PVP攪拌均勻備用，稱取檸檬酸鈉溶于超純水中，按照檸檬酸鈉-硝酸銀的物質(zhì)的量比為5∶1，將檸檬酸鈉溶液逐漸滴入硝酸銀溶液中，滴加完畢后加熱回流反應(yīng)1 h，取懸浮液，9 000 rpm離心30 min，棄上清液取沉淀，用超純水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥至恒重。

1.2.6 納米銀材料的表征

分別采用UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)、ZEN 3600激光粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)、JEM-2010型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)對(duì)納米銀材料進(jìn)行表征。

1.2.7 納米銀材料抗菌性能研究

1.2.7.1 菌懸液的制備

將測(cè)試用的細(xì)菌E.coli、S.aureus分別接種于LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h。取滅菌好的試管兩支分別加入LB液體培養(yǎng)基約15 mL，用接種環(huán)挑取一環(huán)單菌落于試管中，放置于水浴搖床，37 ℃，150 rpm培養(yǎng)18 h。超凈工作臺(tái)上，取少許活化的菌體置于培養(yǎng)基試管中，搖勻，制備成1×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.7.2 最小抑菌濃度的測(cè)定

采用倍比稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)[16]。稱取一定量的大棗納米銀材料、化學(xué)法制備的納米銀材料，用無菌水進(jìn)行配制，使其最終濃度為4 000 μg/mL，隨后依次用無菌水稀釋成系列濃度；將待測(cè)的藥液分別加入96孔板上，每孔中加入50 μL的藥液與50 μL制備好的菌懸液，每次都加有無菌水100 μL陰性對(duì)照和100 μL菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。將96孔板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察，以不產(chǎn)生渾濁的孔所對(duì)應(yīng)的最低濃度為該藥液對(duì)該菌的最小抑菌濃度。

1.2.7.3 最小殺菌濃度的測(cè)定

在得到MIC后，從實(shí)驗(yàn)組的澄清孔中取10 μL培養(yǎng)物，再向其中加入90 μL的LB液體培養(yǎng)基，每個(gè)樣品重復(fù)3次，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每次伴有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。分別觀察培養(yǎng) 24 h平板上有無菌落生長(zhǎng)，無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為該藥液對(duì)該菌的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.8 納米銀材料對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[17]，準(zhǔn)確稱取2.5 mg DPPH溶解定容于100 mL容量瓶中，于冰箱避光保存。將納米銀材料配制成不同質(zhì)量濃度梯度的樣品液，精密量取1 mL樣品溶液加入5 mL試管中，再加入1 mL DPPH溶液，將上述反應(yīng)液置于室溫下暗反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。按下列公式計(jì)算清除率，并用同等質(zhì)量濃度的維生素C(VC)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照:

自由基清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%

式中A0：1 mL DPPH+1 mL超純水；A1：1 mL DPPH + 1 mL樣品；A2：1 mL樣品+1 mL乙醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 大棗水提液還原制備納米銀材料

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)是描述金屬的導(dǎo)電電子在電磁場(chǎng)作用下集體振蕩的一個(gè)物理概念[18]，這種共振在宏觀上表現(xiàn)為金屬納米粒子對(duì)光的吸收；納米銀材料在UV-Vis光譜410 nm附近會(huì)出現(xiàn)特征的等離子體共振吸收峰。因?yàn)榇髼椝嵋汉拖跛徙y溶液在410 nm附近沒有明顯的吸收，因此可以通過UV-Vis吸收光譜在410 nm附近的吸收峰來判斷納米銀材料的生成。首先，我們用大棗水提液原液(pH5.0)直接與AgNO3溶液超聲反應(yīng)1 h，通過UV-Vis光譜測(cè)量判斷是否有納米銀生成。如圖1所示，大棗水提液原液與AgNO3反應(yīng)1 h后UV-Vis光譜在410 nm附近有明顯的吸收峰，表明大棗水提液中的活性成分可以還原AgNO3生成納米銀材料?；谖覀兦捌诘难芯炕A(chǔ)[19]，提高反應(yīng)液的pH可以進(jìn)一步增強(qiáng)水提液中還原性物質(zhì)的活性，使還原反應(yīng)更加高效的進(jìn)行；這主要是因?yàn)樵趬A性條件下，具有還原性的多糖分子以及黃酮類化合物等可能會(huì)以負(fù)離子形式存在，這種存在形式會(huì)使其與Ag+的相互作用增強(qiáng)，從而使還原反應(yīng)更容易進(jìn)行，因此我們進(jìn)行了pH依賴實(shí)驗(yàn)。從圖1可以看出，隨著大棗水提液pH逐漸增大，反應(yīng)液在410 nm附近的吸光度逐漸升高，更大的吸光度數(shù)值表明生成了更多的納米銀材料，這和我們前期的研究結(jié)果一致。此外，我們也注意到：(1)當(dāng)大棗水提液的pH從6.0變化到7.0時(shí)其吸光度值的變化最大，這可能是因?yàn)榇髼椝嵋褐谢钚猿煞衷诖藚^(qū)間內(nèi)變?yōu)樨?fù)離子形式，這更有利于還原反應(yīng)的進(jìn)行，所以使還原反應(yīng)的效率大大提升；但是當(dāng)pH大于7.0時(shí)，隨著溶液pH值增大，410 nm附近吸光度的變化值逐漸減小，這意味增大大棗水提液pH至7.0后其與AgNO3反應(yīng)效率降低，因此我們并沒有嘗試在更高pH值(大于9.0)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；(2)不同pH值大棗水提液還原得到的納米銀材料等離子體共振峰最大吸收并沒有在同一波長(zhǎng)處，根據(jù)文獻(xiàn)[20]，納米銀粒徑的不同會(huì)導(dǎo)致其在UV-Vis光譜上最大吸收波長(zhǎng)不同，這說明大棗水提液的pH不但影響納米銀的生成效率，同時(shí)也影響納米銀的粒徑大小?；谝陨蟨H依賴實(shí)驗(yàn)，我們?cè)趐H9.0時(shí)對(duì)還原反應(yīng)條件進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選。

圖1 不同pH大棗水提液與硝酸銀反應(yīng)后混合液的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectra of the mixtures after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different pH

隨后我們?cè)诖髼椝嵋?pH9.0)與硝酸銀溶液的比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶5時(shí)進(jìn)行了反應(yīng)，考察料液比對(duì)還原反應(yīng)的影響。超聲反應(yīng)1 h后我們發(fā)現(xiàn)：隨著硝酸銀溶液比例增加，UV-Vis光譜上410 nm附近的吸光度值逐漸變小，當(dāng)兩者比例為1∶1時(shí)，410 nm附近的吸光度最大(圖2)，表明在此料液比之下生成的納米銀材料最多；這是因?yàn)殡S著AgNO3用量增大，Ag+周圍的還原性物質(zhì)數(shù)量減少，反應(yīng)速率變慢，所以反應(yīng)相同時(shí)間后(1 h)生成納米銀材料的量減少。進(jìn)一步的，我們嘗試增加反應(yīng)液中還原性物質(zhì)的量(大棗水提液∶AgNO3=2∶1)來提高反應(yīng)效率，但實(shí)際上，當(dāng)料液比為2∶1時(shí)，410 nm附近的吸光度值卻相對(duì)于1∶1時(shí)減少近一半，如圖2所示，這表明在此條件下納米銀材料生成的效率降低。我們推測(cè)這主要是因?yàn)榉磻?yīng)液中還原性物質(zhì)的含量太多，納米銀材料的成核速度太快，以至于來不及生長(zhǎng)為穩(wěn)定的納米銀粒子所導(dǎo)致，而在UV-Vis光譜上我們只能監(jiān)測(cè)到生長(zhǎng)完全且穩(wěn)定的納米銀，所以當(dāng)將大棗水提液的用量提高至2∶1，反應(yīng)相同時(shí)間后生成納米銀材料的量反而變少。

圖2 不同料液比反應(yīng)1 h后混合液的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of the mixtures after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different ratios

進(jìn)一步的，我們?cè)趐H9.0，大棗水提液和硝酸銀比例為1∶1時(shí)，研究了反應(yīng)時(shí)間的影響。我們將0.01 mol/L的AgNO3溶液加入大棗水提液中，分別觀測(cè)反應(yīng)0、1、3、4、6 h后納米銀材料的生成。圖3為反應(yīng)不同時(shí)間后，將反應(yīng)液稀釋20倍后測(cè)得的UV-Vis光譜。從圖中我們發(fā)現(xiàn)：在反應(yīng)0 h時(shí)(大棗水提液)，410 nm附近并沒有顯著的吸收；隨著AgNO3溶液加入反應(yīng)時(shí)間增加后，410 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰，其強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間增加逐漸增加，這說明隨著反應(yīng)時(shí)間的增加體系中生成了更多的納米銀材料；但是當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到4 h后，其反應(yīng)速率明顯變慢(4和6 h時(shí)吸光度值的變化值減小)，這是因?yàn)殡S反應(yīng)的不斷進(jìn)行，大棗水提液中的活性成分被不斷消耗，所以反應(yīng)速率逐漸減小。反應(yīng)條件的篩選表明大棗水提液在pH9.0，與AgNO3的料液比為1∶1，反應(yīng)4 h時(shí)效率最高。

圖3 大棗水提液與硝酸銀溶液反應(yīng)不同時(shí)間后反應(yīng)混合液的UV-Vis吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of the mixture after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different times

2.2 透射電鏡(TEM)表征納米銀材料的形貌

我們使用TEM對(duì)在反應(yīng)效率最高條件下制備的納米銀材料形貌進(jìn)行了表征。具體步驟如下：將制備得到的大棗納米銀材料懸浮液稀釋3倍，滴加一滴在銅網(wǎng)附有碳膜支持的一面，銅網(wǎng)自然晾干3 h后，利用TEM對(duì)其形貌進(jìn)行表征。結(jié)果如圖4(a)所示，從圖中可以看出，我們制備得到的納米銀材料呈近球形，分散較均勻、粒徑大部分分布在20～30 nm之間；這與我們通過化學(xué)制備法得到的納米銀形貌基本類似(圖4(b))，粒徑也相當(dāng)。

2.3 大棗納米銀材料的平均粒徑及zeta電位

取1 mL大棗納米銀材料溶液置于激光粒度儀的測(cè)試皿中，測(cè)試溫度25 ℃，測(cè)量三次。我們分別測(cè)量了不同pH值以及料液比時(shí)納米銀材料的粒徑，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯觯弘S著反應(yīng)液pH逐漸升高，納米銀的平均粒徑從130 nm左右減小到30 nm左右；這主要是因?yàn)楫?dāng)大棗水提液在較大pH時(shí)，大棗水提液中具有還原性的活性成分大多處于負(fù)離子的形式，這種存在形式有利于其與Ag+的相互作用，并導(dǎo)致還原反應(yīng)速率加快，納米銀的成核速度大于生長(zhǎng)速度，因此在較大pH時(shí)生成的納米銀粒徑變小。同時(shí)，我們也考察了不同料液比對(duì)納米銀材料粒徑的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖4可以看出：隨著硝酸銀比例增大，反應(yīng)生成的納米銀材料粒徑逐漸增大，這主要是因?yàn)樵贏g+周圍具有還原性的活性成分含量減少，所以還原反應(yīng)的速率將會(huì)變慢，使得納米銀的成核速度小于生長(zhǎng)速度，所以納米銀顆粒會(huì)不斷生長(zhǎng)形成粒徑更大的材料。最后，我們也對(duì)在反應(yīng)液pH9.0，料液比為1∶1，反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)制得的納米銀材料平均粒徑和zeta電位進(jìn)行了測(cè)量，其中平均粒徑為25.99 ± 1.3 nm，和我們通過TEM得到的結(jié)果完全一致；zeta電位為-29.6 mV(圖5)，說明納米銀材料表面吸附了帶有負(fù)電荷的化合物，這進(jìn)一步證實(shí)了我們上文推測(cè)的在反應(yīng)液pH為堿性時(shí)，大棗水提液中參與還原反應(yīng)的活性物質(zhì)可能是以負(fù)離子形式存在的結(jié)果一致。正是由于這些負(fù)電荷之間的靜電排斥作用使得我們制備得到的納米銀材料不發(fā)生團(tuán)聚，具有較高的穩(wěn)定性。

圖4 (a)大棗水提液；(b)化學(xué)法還原AgNO3制備得到納米銀材料的TEM圖像Fig.4 TEM image of the synthesized AgNPs by (a) jujube aqueous extract;(b) citrate sodium

2.4 納米銀材料對(duì)DPPH自由基的清除能力

接著我們對(duì)所制得的納米銀材料對(duì)于DPPH自由基的清除能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由圖7可以看出：大棗納米銀材料對(duì)DPPH有清除作用，并且清除率隨著大棗納米銀材料濃度增大顯著增加，在0～200 μg/mL范圍內(nèi)呈一定量效關(guān)系；當(dāng)大棗納米銀材料的濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可以達(dá)到83%，這說明制得的納米銀材料具有較強(qiáng)的自由基清除能力；但是當(dāng)納米銀材料的濃度大于100 μg/mL后，清除率隨濃度的變化增加緩慢。

圖5 不同條件下納米銀材料的粒徑Fig.5 Size distribution of AgNPs at different conditions

圖6 納米銀材料的粒徑和zeta電位Fig.6 The zeta potential and size of synthesized AgNPs

2.5 大棗納米銀材料的抑菌活性實(shí)驗(yàn)

隨后，我們進(jìn)行了抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)：大棗水提液制備得到的納米銀材料相比化學(xué)方法制備的納米銀材料(制備方法詳見“1.2.5”，表征數(shù)據(jù)見“2.2”)，抗菌活性大大提高，大棗納米銀材料對(duì)大腸埃希菌的最小抑菌濃度(MIC)為100 μg/mL，對(duì)比化學(xué)方法制備的納米銀材料(500 μg/mL)活性增加了5倍。大棗納米銀材料對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為125 μg/mL，相比于化學(xué)方法制備的納米銀材料(500 μg/mL)其活性增加了4倍，詳見表1。大棗水提液還原法制備的納米銀材料對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均有很強(qiáng)的抑制作用，優(yōu)于化學(xué)方法制備的納米銀材料和大棗水提液?jiǎn)为?dú)使用時(shí)的效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中藥制備的納米銀材料表面會(huì)吸附中藥的活性成分，因此我們推測(cè)納米銀材料表面吸附的大棗水提液活性成分，使得該方法制備的納米銀材料比化學(xué)方法有更好的抗菌活性。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[21]：納米銀材料與細(xì)菌細(xì)胞膜接觸進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，在光的催化作用下會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞中的水或者氧反應(yīng)生成活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，產(chǎn)生的活性氧物種既會(huì)與細(xì)菌的DNA發(fā)生反應(yīng)，干擾細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，也會(huì)與細(xì)菌的蛋白質(zhì)作用使其變性，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡從而產(chǎn)生抗菌效果。利用大棗水提液制備得到的納米銀材料其表面可能被還原性多糖分子所覆蓋，這導(dǎo)致其更容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的大棗納米銀材料數(shù)量多于化學(xué)法制備的納米銀材料，更多的納米銀材料會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧物種，最終會(huì)導(dǎo)致更多的細(xì)菌細(xì)胞死亡，進(jìn)一步增強(qiáng)納米銀材料的抗菌活性，因此使用大棗水提液還原法制備的納米銀材料其抑菌效果更為明顯。

圖7 大棗納米銀材料對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Free radical scavenging assays of AgNPs against DPPH

表1 不同方法制備的納米銀材料及大棗水提液的抑菌活性

注：“-”表示待測(cè)中藥液的MIC>10 mg/mL。

Note： “-” represents the MIC value of jujube aqueous extract is greater than 10 mg/mL。

2.6 納米銀材料的形成機(jī)理

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22]，植物還原法制備納米材料過程中還原性糖類化合物可能起到重要作用。大棗中含有大量還原性多糖，因此我們推測(cè)在反應(yīng)過程中，還原性多糖作為主要的活性成分參與還原反應(yīng)。具體過程可能為：還原性多糖分子中所含有的還原性醛基作為還原劑，經(jīng)過反應(yīng)之后自身會(huì)被氧化成羧基(圖8所示)；此外，由于糖類分子上有著大量的極性羥基和醚氧基團(tuán)，在堿性條件下，糖類化合物中羥基更容易失去質(zhì)子帶有負(fù)電荷，帶有負(fù)電荷的氧原子能通過靜電相互作用將與帶正電荷的Ag+束縛在其周圍，較短的距離更利于還原反應(yīng)的進(jìn)行，因此還原速率增大，這可以從我們的pH依賴實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。同時(shí)這些靜電相互作用還能夠降低Ag+的活動(dòng)性，較快的反應(yīng)速率使納米銀材料的成核速度大于生長(zhǎng)速度(如果生長(zhǎng)速度較快容易造成納米銀粒子團(tuán)聚)，能阻止納米銀材料生長(zhǎng)為粒徑更大的材料；我們使用大棗水提液在最佳反應(yīng)條件時(shí)制備得到的納米銀材料粒徑很小，主要分布在20～30 nm，這從一定層面能證實(shí)我們的推測(cè)。最后，帶有負(fù)電性的多糖分子會(huì)吸附在納米銀材料的表面，因?yàn)閹в胸?fù)電性的羥基之間會(huì)產(chǎn)生靜電排斥作用，防止了納米銀材料之間發(fā)生團(tuán)聚作用形成粒徑更大的納米銀材料甚至于聚沉。

圖8 納米銀材料形成的可能機(jī)制Fig.8 The proposed mechanism for formation of silver nanoparticles

3 結(jié)論

本研究以大棗水提液作為還原劑，利用超聲法在室溫下成功制備了納米銀材料，通過對(duì)反應(yīng)條件(溶液pH、料液比和反應(yīng)時(shí)間)的篩選，得到了最佳反應(yīng)條件(pH9.0，料液比1∶1，反應(yīng)時(shí)間4 h)。進(jìn)一步的理化性質(zhì)表征發(fā)現(xiàn)：(1)反應(yīng)液的pH和料液比對(duì)納米銀材料的粒徑具有較大的影響；(2)在最佳反應(yīng)條件時(shí)制得的納米銀呈近球形、分散較均勻，平均粒徑為25.99±1.3 nm；(3)納米銀材料表面帶負(fù)電性，還原反應(yīng)機(jī)理的初步探討顯示可能是還原性多糖等活性物質(zhì)以負(fù)離子的形式吸附在納米銀表面使其帶有負(fù)電荷，最終起到穩(wěn)定納米銀的作用。最后，生物活性研究顯示：利用大棗水提液還原法制得的納米銀材料對(duì)DPPH自由基具有很高的清除率(83%)；同時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為100和125 μg/mL，為傳統(tǒng)化學(xué)法制得的納米銀材料的5倍和4倍。我們的這些結(jié)果不僅為納米銀材料的制備提供了新的方法，也為大棗資源的開發(fā)利用提供了新的思路。