華愉教，謝 芬，周少丹，王敏偉，仰曉云，陸元杰

江南大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，無錫 214000

太子參為大宗常用中藥材，系石竹科假繁縷屬Pseudostellariarupestris(Turcz.) Pax植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根[1]，具益氣健脾、潤肺生津之傳統(tǒng)功效及促進免疫、止咳、抗腫瘤、抗菌抗氧化、保護心肌功能等藥理作用，臨床上用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥，是治療小兒脾虛而食欲不佳之要藥，療效確切，臨床用量大[2]。目前醫(yī)院中藥房使用的太子參主要有兩種形式：傳統(tǒng)中藥飲片和中藥配方顆粒，其中中藥配方顆粒由單味中藥飲片經(jīng)過水提、濃縮、干燥、制粒而成，在中醫(yī)臨床配方后，供患者沖服使用的一種顆粒制劑，是一種新的飲片使用形式[3]。兩種劑型各有優(yōu)劣[4]，但是劑型的不同勢必會對太子參有效成分的積累產(chǎn)生影響，因而無法保證臨床使用的有效性，并且目前尚未對兩者有效成分進行過深入研究。為了更加全面地了解不同劑型對太子參代謝物合成積累的影響以及太子參飲片和顆粒品質(zhì)的差異，有必要建立基于不同劑型太子參整體化學(xué)成分的質(zhì)量分析方法。

植物代謝組學(xué)技術(shù)是對植物提取物中代謝組進行高通量、無偏差的全面分析技術(shù)，特別適用于中藥多組分復(fù)雜體系的分析[5]。高效液相色譜-串聯(lián)四級桿靜電場軌道阱質(zhì)譜(HPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)采用高效液相色譜對復(fù)雜混合物進行快速分離，結(jié)合高性能四級桿的母離子選擇性與高分辨的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)Orbitrap檢測技術(shù)實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的定性和定量分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測效率高等特點。目前已廣泛用于多種中藥材，如赤芍、人參、宣木瓜等[6-8]。本研究借鑒植物代謝組學(xué)的研究思路和方法，采用HPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS技術(shù)分析太子參飲片和顆?；瘜W(xué)成分的差異性，并通過多元統(tǒng)計和信號通路分析找出差異化學(xué)成分和主要代謝通路，探究其變化規(guī)律，從而為揭示不同劑型對太子參代謝產(chǎn)物合成積累的影響規(guī)律及探討太子參傳統(tǒng)中藥飲片和配方顆粒品質(zhì)形成機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 HPLC高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Q-Exactive Orbitrap/MS四級桿軌道阱質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Compound Discovereru處理軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SIMCA-P 13.0多元統(tǒng)計分析軟件(瑞典Umetrics公司)；Anke TGL-16B離心機(上海安亭科學(xué)儀器公司)；BSA224S電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈、甲醇、超純水(德國Merck公司)；甲酸、L-2-氯苯丙胺酸(美國Sigma-Aldrich公司)。收集太子參傳統(tǒng)中藥飲片(蘇州天靈中藥飲片有限公司)(批號：190730010)和太子參顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司)(批號：19042031)樣品各5份。所有樣品均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為各自種屬藥材，留樣憑證保存于江南大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

太子參中藥飲片：精密稱取飲片10 g，加8倍量的蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后改文火再煎20 min，趁熱濾出藥液，藥渣再加相當(dāng)藥材量6倍量的蒸餾水，煮沸后文火再煎煮30 min，濾過，合并濾液，蒸干。殘渣加入800 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)(2.8 mg/mL，二氯苯丙氨酸)，置于組織研磨儀中65 Hz研磨90 s，隨后40 KHz冰浴超聲30 min，在-20 ℃下靜置1 h，以12 000 rpm離心15 min(置于4 ℃離心機中)，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。太子參配方顆粒：精密稱取配方顆粒10 g，加適量沸水溶解后稀釋至與太子參飲片水煎液相同體積，之后制備方法同上。

2.2 測定條件

色譜條件：色譜柱：Hyper gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)；流動相：水+5%乙腈+0.1%甲酸(A)和乙腈+0.1%甲酸(B)；梯度洗脫程序：0～1.5 min(100%～80%A)，1.5～9.5 min(80%～0%A)，9.5～14.5(0%～0%A)，14.5～14.6(0%～100%A)，14.6～18(100%～100%A)；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，在正離子模式下數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1 000，加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速：45 arb； 輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 kV；毛細管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level，30%。在負離子模式下數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1 100，加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level，60%。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Compound Discoverer軟件對LC/MS檢測數(shù)據(jù)進行提取和預(yù)處理，并在Excel 2010中對數(shù)據(jù)進行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時間、分子量、峰強度等信息。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進行多元統(tǒng)計分析。采用PCA分析通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達不同劑型太子參之間的化學(xué)組成差異；隨后采用PLS-DA和OPLS-DA進一步對樣品進行分類，其中判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2Y(該值為模型的解釋率)及Q2值(該值為模型的預(yù)測率)，R2Y越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測率高。根據(jù)OPLS-DA模型的常用變量載荷評價參數(shù)(VIP)(VIP>1)，并結(jié)合t-test的P值(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物[9]。

2.4 差異化學(xué)成分的鑒定及其代謝通路分析

通過一級質(zhì)譜確定精確的相對分子質(zhì)量，二級質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合METLIN(http://metlin.Scripps.edu/，比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass)數(shù)據(jù)庫在線搜索定性差異化學(xué)成分，將得到的差異化學(xué)成分導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0中，獲得其所在代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 總離子流色譜圖

本實驗供試品溶液制備分別考察了100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇4種溶劑對實驗結(jié)果的影響，同時考察了15、30、45、60、75 min超聲提取時間，結(jié)果表明，以100%甲醇作為溶劑的色譜峰形最優(yōu)且超聲提取30min的相對峰面積最大。因此，最終選擇這種樣品處理方法。流動相的選擇分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈+0.1%甲酸水-乙腈+0.1%甲酸、5%乙腈+0.1%甲酸水-乙腈+0.1%甲酸，結(jié)果表明5%乙腈+0.1%甲酸水-乙腈+0.1%甲酸的峰形較好且分離度較高，因此將其確定為流動相。太子參傳統(tǒng)中藥飲片和配方顆粒樣品在正負離子模式下的HPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS總離子流色譜圖(TIC)示于圖1。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram注：a，c為正離子模式；b，d為負離子模式；a，b為太子參傳統(tǒng)中藥飲片；c，d為太子參配方顆。Note:a and c represent the positive mode;b and d represent the negative mode;a and b represent traditional Pseudostellariae Radix (PR) Chinese medicine decoction pieces;c and d represent PR formula particles.

3.2 多元統(tǒng)計分析

3.2.1 PCA分析

采用的PCA多變量模式識別方法對不同劑型太子參進行降維分析，圖2為其PCA得分散點圖，(正離子模式下，R2X=0.805，Q2=0.686；負離子模式下，R2X=0.886，Q2=0.654)。結(jié)果顯示在正、負離子模式下，不同劑型太子參之間均具有很好的區(qū)分度，這表明太子參傳統(tǒng)中藥飲片和配方顆粒的化學(xué)成分存在明顯差異。

圖2 PCA得分散點圖Fig.2 Scatter plot of PCA 注：a為正離子模式；b為負離子模式。Note:a represents the positive mode;b represents the negative mode.

3.2.2 PLS-DA分析

PCA是無監(jiān)督的分析方法，在確定差異成分時無法忽略組內(nèi)誤差和隨機誤差。因此采用有監(jiān)督模式識別的方法PLS-DA來確定不同劑型太子參之間差異化學(xué)成分[10]。圖3a和3c為不同劑型太子參在質(zhì)譜正、負離子模式下PLS-DA得分散點圖 (在正離子模式下，R2X=0.799，R2Y=0.84，Q2=0.452；在負離子模式下，R2X=0.884，R2Y=0.993，Q2=0.885)，可以看出兩類太子參樣品明顯分開，化學(xué)成分差異明顯。排列實驗是一種外部模型驗證方法，主要用于驗證PLS-DA 模型的擬合程度[11]。通過排列試驗隨機多次(n=200)改變分類變量y 的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機。從圖3b和3d 可見，PLS-DA 模型排列實驗中左端隨機排列產(chǎn)生的R2和Q2值均小于右端的原始值，表明原始模型的預(yù)測能力大于隨機排列y 變量的預(yù)測能力，即模型有效，可以進行后續(xù)的差異成分分析[12]。

圖3 PLS-DA得分散點圖(a，c)和200個排列模型驗證(b，d)Fig.3 Scatter plot of PLS-DA (a,c) and 200 permutation test model validation plot (b,d)注：a，b為正離子模式；c，d為負離子模式。Note:a and b represent the positive mode;c and d represent the negative mode.

3.2.3 OPLS-DA分析

OPLS-DA是以PLS模型的通過驗證為基礎(chǔ)，用于尋找差異化學(xué)成分的一種有監(jiān)督式的分析方法[13]。圖4為太子參飲片和顆粒OPLS-DA散點圖(在正離子模式下，R2X=0.933，R2Y=1，Q2=0.673；在負離子模式下，R2X=0.884，R2Y=0.993，Q2=0.984)，可以看出兩種不同劑型太子參可以顯著分開，且分類效果優(yōu)于PCA分析，組內(nèi)差異降低，更有利于準(zhǔn)確地確定組間差異。圖4c和4d是基于OPLS-DA分析，正負離子模式下的S-Plot，距離中心區(qū)域越遠代表代謝物就是組間分離貢獻越大的代謝物。使用常用VIP值描述變量的貢獻程度，當(dāng)VIP>1時，認為存在潛在的差異化學(xué)成分。

圖4 OPLS-DA得分散點圖(a，b)和S-Plot分析(c，d)Fig.4 Scatter plot of OPLS-DA (a,b) and analysis of S-Plot (c,d)注：a，c為正離子模式；b，d為負離子模式。Note:a and c represent the positive mode;b and d represent the negative mode.

3.3 差異化學(xué)成分的鑒定及其相對含量分析

采用OPLS-DA模型的VIP>1，并結(jié)合t檢驗(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物。通過METLIN數(shù)據(jù)庫在線搜索差異化學(xué)成分的精準(zhǔn)質(zhì)荷比，進而鑒定差異化學(xué)成分。在正離子模式下共找到98個差異化學(xué)成分，負離子模式下共找到52個差異化學(xué)成分，具體見表1和表2。

表1 正離子模式下鑒定出的不同劑型太子參差異化學(xué)成分(P<0.05)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對分子質(zhì)量m/z差異倍數(shù)Fold change64.436Formononetin 7-(6′′-malonylglucoside)C25H24O12516.129 05.64 77.095Sophoraisoflavanone AC21H24O6370.143 20.60 83.730HesperidinC28H34O15610.192 1-0.43 93.575NaringeninC15H12O5272.069 4-1.70 104.314LuteolinC15H10O6286.048 7-1.39 113.731CirsilineolC18H16O7344.090 8-2.78 125.086IsokaempferideC16H12O6300.064 5-2.41 136.000ChrysinC15H10O4254.058 8-4.81 144.863MalvidinC17H15O7330.075 1-4.05 154.989GlyciteinC16H12O5284.069 5-4.41 164.110TangeritinC20H20O7372.122 1-4.06 173.576NaringinC27H32O14580.181 7 -0.77 183.695Luteone 7-glucosideC26H28O11516.165 4-1.69 193.386QuercetinC15H10O7302.043 9-0.72 203.576Naringenin-7-O-glucosideC21H22O10434.123 1-1.02 216.117LiquiritigeninC15H12O4256.074 6-1.69 223.384GenistinC21H20O10432.107 6-2.71 233.562GentisinC14H10O5258.054 0-0.69 有機酸類化合物Organic acids243.270PuerarinC21H20O9416.113 1-2.44 2510.543CamellenodiolC29H46O3442.346 19.72 2610.572Pfaffic acidC29H44O3440.330 57.76 278.221Spinosic acid AC30H48O4472.357 32.92 282.716Indoleacrylic acidC11H9NO2187.064 0-2.33 293.560Sinapic acidC11H12O5224.069 3-1.34 303.527p-Hydroxyphenylacetic acidC8H8O3152.047 9-2.57 315.708(-)-Jasmonic acidC12H18O3210.126 3-1.72 323.703Tropic acidC9H10O3166.063 6-3.05 331.816Cinnamic acidC9H8O2148.053 1-2.27 341.327EpinephrineC9H13NO3183.090 3-3.35 352.893Ferulic acidC10H10O4194.058 8-1.28 361.259NiacinC6H5NO2123.032 6-2.71 373.532Anthranilic acidC7H7NO2137.048 3-5.05 382.892Salicylic acidC7H6O3138.032 3-1.71 391.154DL-pipecolic acidC6H11NO2129.079 6-2.31 401.9303-Indoleacetic acidC10H9NO2175.064 1-5.27 413.487Phenylacetic acidC8H8O2136.053 1-3.41 421.161Benzoic acidC7H6O2122.037 5-1.50 433.139p-Coumaroyl quinic acidC16H18O8338.102 0-1.05

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對分子質(zhì)量m/z差異倍數(shù)Fold change441.3932-Furoic acidC5H4O3112.016 8-1.82 氨基酸類化合物Amino acids451.036Valeric acidC5H10O2102.068 9-2.07 465.157S-adenosylhomocysteineC14H20N6O5S384.122 3-0.88 472.608L-tryptophanC11H12N2O2204.090 4-2.54 481.672L-phenylalanineC9H11NO2165.079 6-2.57 490.996L-tyrosineC9H11NO3181.074 6-2.08 502.726L-glutamineC5H10N2O3146.069 6-1.82 511.005L-methionineC5H11NO2S149.051 6-2.95 521.305L-leucineC6H13NO2131.095 2-2.17 530.973L-prolineC5H9NO2115.063 9-1.79 541.157Pyroglutamic acidC5H7NO3129.043 2-3.15 550.949L-asparagineC4H8N2O3132.054 1-1.73 561.159L-valineC5H11NO2117.079 5-1.41 570.922L-histidineC6H9N3O2155.070 1-1.93 脂肪酸類化合物Fatty acids581.130α-Ketoisovaleric acidC5H8O3116.048 1-2.15 597.416PhytosphingosineC18H39NO3317.294 15.60 608.324LysoPE (0∶0/16∶0)C21H44NO7P453.287 34.68 619.515SphingosineC18H37NO2299.283 44.49 627.920SphinganineC18H39NO2301.299 26.27 6316.271PhosphocholineC5H14NO4P183.066 71.96 648.562LysoPC(16∶0)C24H50NO7P495.334 54.30 650.852CholineC5H14NO103.099 21.51 核苷類化合物Nucleosides665.853JasmoloneC11H16O2180.115 7-1.27 670.880GuanosineC10H13N5O5283.091 72.32 681.155AdenosineC10H13N5O4267.097 6-2.33 692.6735′-MethylthioadenosineC11H16N5O7PS297.090 7-3.52 701.154AdenineC5H5N5135.055 0-2.07 711.157GuanineC5H5N5O151.050 0-1.59 723.038Hydrouracil C4H6N2O2128.059 1-5.01 731.1555′-DeoxyadenosineC10H13N5O3251.103 3-2.72 維生素類化合物Vitamins740.996UracilC4H4N2O2112.028 1-0.57 7510.769Vitamin D2 C28H44O396.340 57.77 762.037Pantothenic acidC9H17NO5219.111 5-3.33 771.694PyridoxamineC8H12N2O2168.090 5-2.08 781.157PyridoxalC8H9NO3167.059 0-4.49

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對分子質(zhì)量m/z差異倍數(shù)Fold change萜類化合物Terpenoids791.154NiacinamideC6H6N2O122.048 7-3.94 803.405Plaunol BC20H20O6356.123 13.55 813.456GenipinC11H14O5226.085 0-4.04 826.161GlutinosoneC14H20O2220.147 1-1.91 酚類化合物Phenols835.360GlabrolideC30H44O4468.326 0-0.58 8410.15α-TocotrienolC29H44O2424.335 26.13 855.323ThymolC10H14O150.104 9-2.10 生物堿類化合物Alkaloids866.1316-GingerolC17H26O4294.184 1-2.61 878.043TerminalineC23H41NO2363.315 24.99 880.892TrigonellineC7H7NO2137.048 3-1.60 兒茶酚胺類化合物Catecholamines891.151L-nicotineC10H14N2162.116 4-1.85 901.163Norepinephrine C8H11NO3169.074 5-3.19 911.010L-dopaC9H11NO4197.069 5-1.93 胺類化合物Amines923.719DopamineC8H11NO2153.079 5-3.69 931.164HistamineC5H9N3111.080 3-2.85 甾體類化合物Steroids952.907CaprolactamC6H11NO113.084 8-2.95 香豆素類化合物Coumarins964.033Soyasapogenol CC30H48O2440.367 19.24 酮類化合物 Ketones962.979CoumarinC9H6O2146.037 3-2.23 醛類化合物Aldehydes975.300Cis-jasmoneC11H16O164.120 6-3.91 983.3114-HydroxybenzaldehydeC7H6O2122.037 5-3.54

表2 負離子模式下鑒定出的不同劑型太子參差異化學(xué)成分(P<0.05)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對分子質(zhì)量m/z差異倍數(shù)Fold change43.652 Diosmin C28H32O15608.170 5 3.17 54.435 FormononetinC16H12O4268.072 1 6.62 64.306 TangeritinC20H20O7372.119 6 -2.89 74.094 TaxifolinC15H12O7304.056 8 -2.21 84.312 LuteolinC15H10O6286.046 2 -3.36 93.785 Naringenin-7-O-glucosideC21H22O10434.119 1 -2.46 103.625 AstragalinC21H20O11448.098 3 -1.23 113.589 3′′,4′′-DiacetylcosmosiinC25H27NO11516.123 7 -3.37 124.979 GlyciteinC16H12O5284.066 8 -1.05 136.114 LiquiritigeninC15H12O4256.072 1 -1.46 145.997 ChrysinC15H10O4254.056 4 -3.77 156.934 GenisteinC15H10O5270.051 3 -2.91 164.852 MalvidinC17H15O7330.072 1 -4.38 174.070 DaidzeinC15H10O4254.056 5 -3.62 183.064 GallocatechinC15H14O7306.075 6 -3.31 194.541 HesperetinC16H14O6302.077 0 -3.23 203.064 KeiosideC28H32O16624.165 2 -0.62 有機酸類化合物Organic acids214.494 EriodictyolC15H12O6288.061 6 -2.77 220.904 Succinic acidC4H6O4118.026 0 0.47 230.906 Citric acidC6H8O7192.025 2 3.37 240.983 D-glucarateC6H10O8210.035 6 2.49 255.620 (-)-Jasmonic acidC12H18O3210.123 6 1.83 265.447 Auxin aC18H32O5328.223 7 -1.21 273.631 Tropic acidC9H10O3166.062 4 -1.94 282.863 p-Coumaroyl quinic acidC16H18O8338.098 8 -3.19 290.890 Glutaric acidC5H8O4132.041 6 -2.92 303.760 Sebacic acidC10H18O4202.119 4 -1.55 315.850 Hexadecanedioic acidC16H30O4286.212 8 -1.30 320.904 Citramalic acidC5H8O5148.036 2 -0.44 330.956 Quinic acidC7H12O6192.062 2 -2.72 脂肪酸類化合物Fatty acids343.965 Nonanedioic acidC9H16O4188.103 1 -0.97 359.063 LPA(0∶0/16∶0)C19H39O7P410.241 8 4.49 363.261 6′′-MalonylapiinC29H30O17650.146 1 5.43 378.322 LysoPE(0∶0/16∶0)C21H44NO7P453.283 4 4.97 3810.105 Linoleic acidC18H32O2280.238 5 3.80 糖類化合物Carbohydrates395.287 Traumatic acidC12H20O4228.134 6 -3.00

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對分子質(zhì)量m/z差異倍數(shù)Fold change400.842 SucroseC12H22O11342.114 6 1.04 410.827 RaffinoseC18H32O16504.166 7 1.09 420.892 3′-SialyllactoseC23H39NO19633.208 7 -1.81 維生素類化合物Vitamins430.912 α-D-glucoseC6H12O6180.061 6 -1.13 440.876 L-ascorbic acidC6H8O6176.031 4 0.31 452.037 Pantothenic acidC9H17NO5219.109 2 -1.85 核苷類化合物Nucleosides462.751 RiboflavinC17H20N4O6376.135 1 -2.27 470.915 ThymidineC10H14N2O5242.089 0 0.73 氨基酸類化合物Amino acids481.158 UridineC9H12N2O6244.068 1 0.52 苯丙素類化合物Phenylpropanoids490.833 L-glutamateC5H7NO4147.052 3 1.35 兒茶酚胺類化合物Catecholamines502.491 Chlorogenic acidC16H18O9354.093 4 -0.83 萜類化合物Terpenoids511.156 L-dopaC9H11NO4197.067 4 -1.85 524.461 Abscisic acidC15H20O4264.134 5 -1.52

3.4 差異化學(xué)成分的相對含量分析

正離子模式下太子參飲片(TY)相對含量>太子參顆粒(TK)相對含量的有23個，TYTK的有19個，TY0，表明TY相對含量>TK相對含量；fold change<0，則TY相對含量TK相對含量的差異化學(xué)成分分布于9類化合物中，其中黃酮和脂肪酸類化合物占比最高，均為31%。TY相對含量TK相對含量的差異化學(xué)成分歸屬于7類化合物，其中最主要的是黃酮類化合物(5個，26%)，其次為有機酸類(4個，21%)和脂肪酸類(4個，21%)。TY相對含量

3.5 代謝通路分析

通過MetaboAnalyst網(wǎng)站構(gòu)建代謝通路分析，將上述鑒定的化合物的KEGG導(dǎo)入MetaboAnalyst進行通路分析。利用拓撲Fenix，代謝通路影響的臨界值(Impact值)設(shè)置為0.6，大于這個值將被選擇作為潛在的關(guān)鍵代謝通路。如圖6所示，圓點的半徑大小代表代謝通路的Impact值，Impact值越大，半徑越大；圓點的顏色代表代謝通路的P值，P值越小，顏色越紅。綜上，共富集到異喹啉生物堿生物合成(A)1條重要的代謝通路，主要涉及的差異化學(xué)成分是L-tyrosine(酪氨酸)、L-dopa(左旋多巴)、dopamine(多巴胺)。

圖5 正負離子模式下不同劑型太子參差異化學(xué)成分的含量對比分析Fig.5 Comparative analysis of contents of different chemical components in Pseudostellariae Radix with different dosage forms under positive and negative ions mode注：a為正離子模式TY相對含量>TK相對含量的差異化學(xué)成分；b為正離子模式TY相對含量TK相對含量的差異化學(xué)成分；d為負離子模式TY相對含量PR formula granules in ESI+;b represents The relative contents of differential chemical compositions in PR decoction piecesPR formula granules in ESI-;d represents The relative contents of differential chemical compositions in PR decoction pieces

圖6 信號通路分析 Fig.6 Analysis of pathway impact 注：A為異喹啉生物堿生物合成。Note:A represents isoquinoline alkaloid biosynthesis.

4 結(jié)論

本實驗建立了基于HPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)的不同劑型太子參差異化學(xué)成分的分析方法，并從樣品制備、色譜圖分析、數(shù)據(jù)處理、代謝通路分析等方面進行探討，找出累計差異顯著的化學(xué)成分，探索其變化規(guī)律。實驗結(jié)果表明，HPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS可以準(zhǔn)確獲得化合物的分子質(zhì)量和裂解碎片質(zhì)量信息，快速鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。經(jīng)多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)不同劑型太子參樣品中化學(xué)成分存在明顯差異，并在正、負離子模式下分別找到98個和52個差異化學(xué)成分，這些成分主要集中在黃酮、有機酸、脂肪酸、氨基酸類化合物中，主要涉及類異喹啉生物堿生物合成代謝。此外，無論是在正離子或負離子模式下，太子參顆粒中相對含量較高的差異化學(xué)成分的數(shù)量和種類均多于太子參飲片，包括具有抗腫瘤作用的黃酮類化合物、含有抗菌抗氧化作用的有機酸類化合物、具有促進免疫作用的氨基酸類化合物等。

該結(jié)果可為揭示不同劑型對太子參代謝產(chǎn)物合成積累的影響規(guī)律以及不同劑型太子參品質(zhì)形成機制提供基礎(chǔ)資料，為復(fù)雜體系樣品分析、差異化學(xué)成分的鑒定提供一種可靠和準(zhǔn)確的參考方法。