陳 亮，陸雪瑩，黃烈軍，蹇軍友，金 軍，顧 瑋，苑春茂，郝小江*

1貴州大學藥學院，貴陽 550025；2貴州醫(yī)科大學藥用植物功效與利用國家重點實驗室；3貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴陽 550014；4中國科學院干旱區(qū)植物資源化學重點實驗室；5中國科學院新疆理化研究所，烏魯木齊 830011

莪術為姜科植物莪術、郁金、廣西莪術的干燥根莖，目前已大量人工栽培，資源充足，莪術醇為莪術油的主要活性成分，在莪術油中含量7%～8%，對莪術油藥效的貢獻最大[1]。文獻報道莪術醇皮下注射對小鼠肉瘤S37、宮頸癌U14、艾氏腹水癌均有明顯的抑制作用[2]。為了探索對黑色素的影響，我們選用黑色素瘤(B16)細胞，進行了莪術醇對細胞內(nèi)黑色素含量的測定并以莪術醇為前體，對其化學結(jié)構進行修飾，合成了系列衍生物，以期發(fā)現(xiàn)新的抑制黑色素含量的化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

莪術油購自江西吉安市青原區(qū)友才天然香料油有限公司；實驗所用試劑除特別說明外皆為市售分析純試劑，且未經(jīng)純化直接使用；B16小鼠黑色素瘤細胞購自中國科學院細胞庫，目錄號TCM 2；核磁共振儀:INOVA-400和600型(Bruker公司，瑞士，TMS為內(nèi)標)；ESI-MS質(zhì)譜儀:惠普LC-MSD型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 莪術醇制備

將購得的2 kg莪術油經(jīng)粗硅膠(40～80目)拌樣后，進行柱層析色譜(石油醚∶乙酸乙酯=60∶1)的分離得到含莪術醇粗品，將所得到的粗品進行重結(jié)晶(乙醇)，得到185 g白色晶體，易溶于氯仿。

1.3 莪術醇衍生物的制備

莪術醇衍生物的設計合成路線見圖1。

圖1 莪術醇衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route of curcumol derivatives注：試劑及反應條件(a)HBr，acetone，60 ℃(b)O3，Me2S，-78 ℃；(c)(BMIM)NTf2，(CH2O)n，i-Pr2NH·TFA；(d)Chloroacetic anhydride，NaH，DCM；(e)BOC-L-Leucine，NaHCO3，CSF，DMF；(f)m-CPBA，DCM；(g)NaOH，isopropyl alcohol；(h)NIS，PPh3，DCM；(i)Diethylamine，K2CO3，THF，70 ℃/NH3·H2O，40 ℃；(j)Carboxylic acid，DMAP，DCC，DCM；(k)4-Nitrobenzoyl chloride，NaH，KI，DMF。

1.3.1 2，7-二異丙基-1，4-二甲基-2，3-二氫環(huán)戊烷并環(huán)庚三烯-6(1H)-酮(1)的制備

在50 mL反應瓶中加入30 mL丙酮，再加入5 mL 40%的氫溴酸溶液，在此體系中加入無水硫酸鈉干燥三小時，再加入五氧化二磷深度除水，過濾，得濾液[3]。將100 mg莪術醇溶于此濾液中，加熱回流，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加入飽和碳酸氫鈉溶液中和體系中過量的溴化氫，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得35 mg白色固體(1)。

1.3.2 (3S，3aS，5S，6R，8aR)-3-甲基-5-異丙基-7-甲烯基-8H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇-8-酮(2)的制備

在50 mL反應瓶中加入20 mL二氯甲烷(DCM)，加入100 mg莪術醇，置于低溫反應器中，將溫度設置為-78 ℃，在此溫度下攪拌15 min[4]。隨后，利用臭氧發(fā)生裝置，向反應體系中通入臭氧，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加入0.2 mL二甲硫醚，室溫攪拌3 h后，依次用飽和亞硫酸氫鈉，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得48 mg無色透明液體(Z-1)。

在25 mL反應瓶中，依次加入2 mL 1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亞胺((BMIM)NTf2)，中間體Z-1(19 mg，0.08 mmol)，多聚甲醛(5 mg，0.16 mmol)及催化劑三氟乙酸二異丙基胺鹽(i-Pr2NH·TFA)(18 mg，0.08 mmol)，70 ℃下反應[5,6]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用1 N的鹽酸水溶液,1 N的氫氧化鈉水溶液，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，刮板，得17 mg白色固體(2)。

1.3.3 2-((3S，3aS，5S，6R，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-甲烯基八氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇)-2-氧代乙基BOC-L亮氨酸(3)的制備

在50 mL反應瓶中，加入20 mL二氯甲烷 (DCM)，加入莪術醇(300 mg，1.27 mmol)及氫化鈉(NaH)(305 mg，12.7 mmol)，室溫攪拌30 min，隨后加入氯乙酸酐(543 mg，3.2 mmol)，室溫攪拌[4]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=100∶1)得257 mg無色透明液體(Z-2)。

在25 mL反應瓶中，加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再依次加入中間體Z-2(22 mg，0.071 mmol)，BOC-L亮氨酸(17 mg，0.071 mmol)，碳酸氫鈉(NaHCO3)(6 mg，0.071 mmol)以及催化量的氟化銫(CSF)，室溫攪拌15 min，隨后加熱至70 ℃反應，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1)得28 mg無色透明液體(3)。

1.3.4 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-(N，N-二乙基-氨基甲基)-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇(4a)的制備

在100 mL反應瓶中，加入50 mL二氯甲烷(DCM)，加入莪術醇(1 g，4.24 mmol)及間氯過氧苯甲酸(1.096 g，6.36 mmol)，室溫下攪拌[4]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和亞硫酸氫鈉，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，得粗品中間體(Z-3)，將其溶于30 mL異丙醇中，加入氫氧化鈉(512 mg，12.72 mmol)，70 ℃下反應，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)得744 mg白色固體(Z-4)。

在50 mL反應瓶中，加入20 mL二氯甲烷(DCM)，依次加入中間體Z-4(300 mg，1.2 mmol)，N-碘代丁二酰亞胺(NIS)(405 mg，1.8 mmol)及三苯基膦(PPh3)(471mg，1.8mmol)，室溫下攪拌[7]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=15∶1)得264 mg淺黃色液體(Z-5)。

在25 mL反應瓶中，加入10 mL 四氫呋喃(THF)，依次加入中間體Z-5(100 mg，0.276 mmol)，二乙胺(43 μL，0.414 mmol)及碳酸鉀(K2CO3)(57 mg，0.414 mmol)，70 ℃下反應[8]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶丙酮=20∶1)得77 mg淺黃色透明液體(4a)。

1.3.5 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-氨甲基-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇(4b)的制備

在25 mL反應瓶中，加入中間體Z-5(132 mg，0.365 mmol)及14 mL氨水，40 ℃下反應[8]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(三氯甲烷∶甲醇=20∶1)得48 mg白色固體(4b)。

1.3.6 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-8-[(2-甲基-苯甲酰氧基)甲基]-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇(5a)的制備

在25 mL反應瓶中，加入10 mL二氯甲烷(DCM)，再依次加入中間體Z-4(31 mg，0.4 mmol)，鄰甲基苯甲酸(20 mg，0.15 mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(76 mg，0.369 mmol)及催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌[9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和碳酸氫鈉，飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得32 mg無色透明液體(5a)。

1.3.7 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-8-[(3，5-二硝基-苯甲酰氧基)甲基]-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇(5b)的制備

在25 mL反應瓶中，加入15 mL二氯甲烷(DCM)， 再依次加入中間體Z-4(103 mg，0.41 mmol)，3,5-二硝基苯甲酸(104 mg，0.49 mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(253 mg，1.23 mmol)及催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌[9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和碳酸氫鈉，飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得106 mg白色固體(5b)。

1.3.8 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環(huán)氧莪術-6-醇對硝基苯甲酸二酯(6)的制備

在50 mL反應瓶中，加入15 mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，依次加入中間體Z-4(158 mg，0.627 mmol)，氫化鈉(NaH)(150 mg，6.27 mmol)及催化量碘化鉀(KI)，室溫攪拌15 min，隨后加入對硝基苯甲酰氯(348 mg，1.88 mmol)，室溫下攪拌[4,9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經(jīng)柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得137 mg白色固體(6)。

1.4 莪術醇衍生物抑制黑色素含量的測定

所合成的莪術醇衍生物1、2、3、4a、4b、5a、5b、6，采用NaOH裂解法測定細胞內(nèi)的黑色素含量[10]。將處于對數(shù)生長期的B16細胞消化，接種于6孔板中，濃度為2×105個/孔，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞完全貼壁后用藥，并繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄去上清液，PBS洗滌2次，使用細胞刮收集細胞后每孔加入細胞裂解液200 μL。于4 ℃充分裂解40 min后，12 000 rpm離心20 min。轉(zhuǎn)移上清至EP管測定蛋白濃度。沉淀物中加入190 μL 1 mol/L的NaOH(含10% DMSO)裂解液，并于80 ℃水浴1 h充分溶解后，在405 nm處測定吸光值，最終的黑色素含量使用相對蛋白濃度歸一化處理。計算公式為黑色素相對含量=(OD405樣品/蛋白濃度)/(OD405空白/蛋白濃度)×100%，每個樣品重復3次進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 莪術醇的結(jié)果表征

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：4.87(s，2H，H-9)，2.55(m，2H，H-7)，2.14(m，2H，H-4)，1.00(d，J=4.0 Hz，3H，H-12)，0.90(d，J=4 Hz，3H，H-11)，0.86(d，J=4 Hz，3H，H-13)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：144.8(C-8)，113.0(C-9)，104.7(C-6)，88.2(C-3a)，56.4(C-5)，54.6(C-8a)，39.5(C-3)，38.9(C-7)，34.8(C-4)，31.0(C-2)，28.8(C-10)，28.3(C-1)，23.2(C-11)，21.6(C-12)，12.5(C-13)；HR-ESI-MS:m/z259.1667 [M+Na]+(calcd for C15H24O2Na，259.1669)。與文獻[11-13]中莪術醇的核磁數(shù)據(jù)比較，確定所得晶體化合物為莪術醇。

2.2 莪術醇衍生物的結(jié)果表征

化合物1白色固體，收率33%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.08(s，1H，H-6)，7.00(s，1H，H-9)，3.46(hept，J=6.8 Hz，1H，H-11)，3.07(p，J=7.0 Hz，1H，H-4)，2.81 (dd，J=16.7，7.7 Hz，1H，H-2)，2.54(dd，J=16.7，11.5 Hz，1H，H-2)，2.22(s，3H，H-14)，1.92(m，1H，H-3)，1.73(m，1H，H-6)，1.17(d，J=3.1 Hz，3H，H-15)，1.16(d，J=3.1 Hz，3H，H-12 or H-13)，1.04(d，J=7.1 Hz，3H，H-12 or H-13)，0.99 (d，J=2.0 Hz，3H，H-17 or H-18)，0.98(d，J=2.2 Hz，3H，H-17 or H-18)；13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ：185.3(C-8)，158.6(C-7)，151.8(C-5)，144.9(C-1)，144.8 (C-10)，138.8(C-9)，130.7(C-6)，48.7(C-3)，46.7(C-4)，38.6(C-2)，29.7(C-11)，28.3(C-16)，25.0(C-14)，22.6(C-12)，22.4(C-13)，21.7(C-17)，21.6 (C-18)，14.2(C-15)；HR-ESI-MS:m/z281.187 3 [M+Na]+(calcd for C18H26ONa，281.187 6)。

化合物4a淺黃色透明液體，收率90%。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：5.76(s，1H，H-7)，3.10(d，J=13.1 Hz，1H，H-9)，2.77(d，J=13.5 Hz，1H，H-9)，2.61(s，2H，H-1′)，2.40(s，2H，H-1′′)，1.02(d，J=6.7 Hz，12H，H-11，H-12，H-2′ and H-2′′)，0.90(d，J=6.6 Hz，3H，H-13)；13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ：143.1(C-8)，126.0(C-7)，103.4(C-6)，87.0(C-3a)，59.5(C-9)，56.8(C-5)，50.3(C-8a)，47.0(C-1′ and C-1′′)，40.3(C-3)，36.7(C-4)，31.2(C-2)，31.0(C-10)，27.4(C-1)，22.7(C-11)，21.4(C-12)，11.8(C-13)，11.6(C-2′ and C-2′′)；HR-ESI-MS:m/z308.258 4 [M+H]+(calcd for C19H34NO2，308.258 4)。

化合物4b白色固體，收率53%。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：7.97(s，2H，N上氫)，6.15 (s，1H，H-7)，3.72(d，J=14.6 Hz，1H，H-9)，3.63(d，J=15.5 Hz，1H，H-9)，1.01(d，J=5.9 Hz，3H，H-12)，0.99(d，J=6.5 Hz，3H，H-11)，0.86(d，J=6.0 Hz，3H，H-13)；13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ：136.33(C-8)，127.54(C-7)，103.83(C-6)，87.33(C-3a)，58.62(C-5)，50.53(C-8a)，42.20(C-9)，40.17(C-3)，35.94(C-4)，31.30(C-2)，30.44(C-10)，27.52(C-1)，22.68(C-11)，21.90(C-12)，11.82(C-13)；HR-ESI-MS:m/z252.195 4 [M+H]+(calcd for C15H26NO2，252.195 8)。

2.3 細胞內(nèi)黑色素含量測定

表1 細胞內(nèi)黑色素含量測定

經(jīng)Grphpad prism軟件分析，各組之間對比，均無顯著性差異，其中與陰性對照組相比，化合物1、2、3、4a、4b、5a、5b、6以及莪術醇的P值分別為0.94、0.78、0.63、0.60、0.74、0.40、0.19、0.13、0.23。由含量測定結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，先導化合物莪術醇具有一定美白作用，8個衍生物中有2個衍生物的抑制黑色含量的作用超過莪術醇。中間體Z-4，9位羥基上接入3，5-二硝基苯甲酸(5b)，成酯鍵后作用比莪術醇強；中間體Z-4，9位羥基和半縮酮羥基上都接入對硝基苯甲酰氯(6)成酯鍵后作用也比莪術醇強，而且也比化合物5b的作用強。而中間體Z-4，9位羥基上接入鄰甲基苯甲酸(5a)，成酯鍵后作用則明顯降低，比莪術醇弱。由此可見Z-4中間體羥基上引入苯環(huán)上具有吸電子基團的苯甲酸成酯鍵后的抑制黑色含量的作用要優(yōu)于引入苯環(huán)上具有給電子基團的苯甲酸。莪術醇在酸性條件下發(fā)生開環(huán)重排得到的衍生物1，針對半縮酮羥基的修飾，得到的衍生物3，莪術醇經(jīng)過臭氧化，再經(jīng)過mannich反應，得到具有α，β不飽和酮結(jié)構的衍生物2，以及引入含氮基團得到的衍生物4a和4b，其作用均比莪術醇弱。

3 結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)莪術醇具有抑制B16細胞中黑色素的活性，具有一定的美白作用。以莪術醇為前體，制備了8個系列衍生物，其中2、3、5a、5b、6為新化合物，經(jīng)抑制黑色素含量的測定，其中衍生物5b和6的抑制黑色素含量的作用要優(yōu)于莪術醇。經(jīng)初步的構效關系分析可知，在中間體Z-4羥基上引入苯環(huán)上具有吸電子基團的苯甲酸成酯鍵后的抑制黑色素含量的作用要優(yōu)于引入苯環(huán)上具有給電子基團的苯甲酸。研究結(jié)果對于莪術醇的結(jié)構修飾及其美白作用的深入研究具有一定的參考價值。