李凱琳，熊 佩，龔開妍，彭 婕，史思林，蔡 偉,2,3*

1湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院；2新型抗體藥物及其智能運(yùn)輸系統(tǒng)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化 418000

侗藥馬卡列丙Duhaldeanervosa是菊科旋覆花屬顯脈旋覆花的全草，分布于廣西、云南、貴州等地，又有毛秀才、小黑藥之稱，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、消腫止痛的作用，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、骨折等病痛[1]。目前國內(nèi)外關(guān)于馬卡列丙的化學(xué)成分的系統(tǒng)研究較少，已分離得到的化學(xué)成分僅有57個，主要為揮發(fā)油類，甾體，和萜類等化學(xué)成分[2]，本課題組前期采用液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合質(zhì)譜樹相似度過濾技術(shù)鑒定了47個綠原酸類成分[3]，其他成分鮮有報道。近年來，超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，因其高分辨率，靈敏度和高分離度，被廣泛的應(yīng)用于食品，環(huán)境，藥物等，尤其是中藥中成分的定性分析。為了進(jìn)一步深入的了解馬卡列丙中未知的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS結(jié)合離子排除列表，快速、有效、準(zhǔn)確地對侗藥馬卡列丙中化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，為侗藥馬卡列丙的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Q-Exactive Focus 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀與Dionex UltiMate 3000戴安高效液相色譜儀(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)，Mighty-10超純水機(jī)(上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司)，電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

馬卡列丙購自云南，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院汪冶教授鑒定為顯脈旋覆花Duhaldeanervosa的根。色譜甲醇、乙腈(Macklin公司)、甲酸(賽默飛世爾科技有限公司)均為液質(zhì)純，其他試劑皆為分析純。

檸康酸(批號 GE6650000)、4-羥基苯甲酸(批號 DH1925000)、水楊酸(批號 VO0525000)、沒食子酸(批號 LW7525000)、順式烏頭酸(批號 20190512)、辛二酸(批號 20190620)、壬二酸(批號 CM1980000)、阿魏酸(批號 UD3365500)、十四烷二酸(批號 20190601)、脫落酸(批號 20190529)、間苯二甲酸(批號 NT2007000)均購自山東西亞化學(xué)股份有限公司；L-(-)-蘋果酸(批號 M105695)、N-乙酰纈氨酸(批號 A109366)，4-香豆酸(批號 LotK1805057)、咖啡酸(批號 C108306)、檸檬酸(批號 C108869)、丁香酸(批號 S104156)均購自aladdin；酒石酸(批號 2018042074)購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，以上純度均大于98%。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的制備

分別精確稱取檸康酸、L-(-)-蘋果酸、4-羥基苯甲酸、水楊酸、酒石酸、N-乙酰纈氨酸、4-香豆酸、間苯二甲酸、沒食子酸、順式烏頭酸、辛二酸、咖啡酸、壬二酸、檸檬酸、阿魏酸、丁香酸、十四烷二酸、脫落酸適量，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取馬卡列丙粉末50 g置于圓底燒瓶中，加入400 ml 50%乙醇溶液，回流提取兩次，每次1 h，合并所得提取液，在50 ℃條件下減壓濃縮后得浸膏，浸膏用適量的甲醇溶解，樣品溶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫：0～2 min，95%→90% A；2～5 min，90%→80% A；5～10 min，80%→70% A；10～12 min，75%→45% A；12～20 min，45%→20%A；20～25 min，20%→5% A;25～26 min，5%→95% A；26～30 min，95% A。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子模式下掃描，數(shù)據(jù)采用一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴性前三強(qiáng)二級子離子掃描并結(jié)合排除離子列表模式(Full Scan MS/dd-MS2/Exclusion list)，質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1 200；分辨率為35 000；噴霧電壓為3 kV；鞘氣壓力為30 arb;輔助氣壓力為10 arb；毛細(xì)管溫度為320 ℃；S-lens為50。

3 結(jié)果與分析

3.1 液質(zhì)條件的優(yōu)化

為了能獲得更好的色譜峰型和分離度，本實(shí)驗(yàn)考察了不同的溶劑種類，如甲醇，乙腈，水等；不同的酸的不同濃度，如0.1%甲酸、0.05%甲酸、0.1%乙酸、0.05%乙酸等；不同的流動相梯度；不同的柱溫；最終結(jié)果表明乙腈和0.1%甲酸水，在35 ℃時分離效果最合適。

常規(guī)的數(shù)據(jù)采集模式(Full Scan MS/dd-MS2)，對于共流出時的微量成分(強(qiáng)度非前三強(qiáng)的離子)，不能采集到二級數(shù)據(jù)，因此這類成分在用液質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定時，往往會造成丟失。為了解決微量成分的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集問題，本實(shí)驗(yàn)建立了數(shù)據(jù)采用一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴性前三強(qiáng)二級子離子掃描并結(jié)合排除離子列表的數(shù)據(jù)采集模式。排除離子列表中的離子的來源有兩方面，來源一為儀器本身的離子干擾，具體方法為，進(jìn)空白溶液，從空白溶液中，選擇離子響應(yīng)強(qiáng)度前100強(qiáng)的離子，導(dǎo)入排除離子列表。來源二為本課題組前期從該植物中已鑒定的化合物，主要為綠原酸類成分。使用該方法，可以采集到更多微量未知成分的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用于成分的結(jié)構(gòu)解析。

3.2 樣品中成分的鑒定

通過對照品，參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫，從侗藥馬卡列丙中共鑒定了40個化學(xué)成分，其高分辨提取離子流圖如圖1所示，各化學(xué)成分的保留時間，準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比的理論值和實(shí)測值，碎片離子等數(shù)據(jù)，如表1所示。

圖1 馬卡列丙提取物在負(fù)離子模式下的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS提取離子流圖Fig.1 The extract ion chromatogram of in negative ion mode of extract from D.nervosa using UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

表1 馬卡列丙中化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.tR(min)理論值Theoretical mass 實(shí)際值Experimental mass 誤差Error(ppm)分子式Formula[M-H]-裂解碎片MS/MS fragment鑒定結(jié)果Identification result50.99145.014 25145.013 06-4.40C5H5O5MS2[145]:101.023 1(100),127.024 0(27),83.012 5(27),126.018 4(21),57.033 2(17)2-氧戊二酸60.99173.009 16173.008 21-2.33C6H5O6MS2[173]:111.007 5(100),85.028 1(16)反式烏頭酸71.11133.014 25133.013 05-4.87C4H5O5MS2[133]:115.002 3(100),71.012 4(43)D-(+)-蘋果酸81.24173.009 16173.008 13-2.79C6H5O6MS2[173]:85.028 1(100),111.007 4(29),129.018 1(25)順式烏頭酸91.26188.056 46188.055 57-4.71C7H10O5NMS2[188]:128.034 1(100),102.054 7(66),144.065 5(38),59.012 5(35),170.044 9(29)N-乙酰-谷氨酸101.42147.066 28147.065 17-3.83C6H11O4MS2[147]:129.054 5(100),101.059 4(58),59.012 4(36)甲羥戊酸111.56169.014 25169.013 28-2.47C7H5O5MS2[169]:125.023 2(100)沒食子酸121.69129.019 33129.018 17-0.07C5H5O4MS2[129]:85.028 1(100),72.991 7(55),83.048 8(24),128.034 0(18)檸康酸132.08191.056 11191.055 21-4.72C7H11O6MS2[191]:101.059 4(100),115.038 8(42),129.054 5(42),145.049 4(13),72.991 7(10)D-(-)-奎寧酸142.50218.103 40218.102 74-3.01C9H16O5NMS2[218]:88.039 0(100),146.081 1(52)泛酸152.82153.019 33153.018 26-3.42C7H5O4MS2[153]:109.028 2(100)原兒茶酸163.42151.040 07151.038 96-7.33C8H7O3MS2[151]:121.064 5(100),107.048 9(79),123.043 8(68)2-羥基苯乙酸173.47375.129 67375.129 49-0.48C16H23O10MS2[375]:151.075 2(100),146.986 3(99),213.076 3(57),169.085 9(53),125.059 5(50),107.049 0(30),101.022 9(29)Mussaenosidic acid183.59158.082 27158.081 16-3.53C7H12O3NMS2[158]:116.0704(100),130.9824(24)N-乙酰纈氨酸193.63203.082 60203.081 88-3.55C11H11O2N2MS2[203]:116.049 2(100),74.023 3(38),72.007 7(32),142.065 0(27),159.091 8(21)色氨酸204.17137.024 42137.023 28-8.30C7H5O3MS2[137]:93.033 1(100)4-羥基苯甲酸214.34175.061 20175.060 24-2.33C7H11O5MS2[175]:115.038 7(100),113.059 4(38),85.064 5(33)2-異丙基蘋果酸224.37164.071 70164.070 60-3.37C9H10O2NMS2[164]:147.044 0(100),72.007 7(22)苯丙氨酸234.92181.050 63181.049 73-1.95C9H9O4MS2[181]:135.493 9(100),163.039 0(63),136.982 3(29),119.043 9(11)4-羥基苯乳酸245.03179.034 98179.033 98-2.53C9H7O4MS2[179]:135.043 9(100)咖啡酸255.33197.045 55197.044 69-4.35C9H9O5MS2[197]:182.021 0(100),153.054 3(23)丁香酸265.59131.071 37131.070 22-4.57C6 H11O3MS2[131]:85.064 5(100)2-羥基己酸275.75131.071 37131.070 16-5.03C6 H11O3MS2[131]:85.064 5(100)2-羥基己酸285.85165.019 33165.018 23-6.68C8H5O4MS2[165]:121.027 9(100)間苯二甲酸296.41163.040 07163.039 05-2.88C9 H7O3MS2[163]:119.048 9(100),120.052 2(6)4-香豆酸306.53165.055 72165.054 72-2.72C9H9O3MS2[165]:121.064 6(100),147.043 9(25)3-(4-羥基苯基)丙酸

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.tR(min)理論值Theoretical mass 實(shí)際值Experimental mass 誤差Error(ppm)分子式Formula[M-H]-裂解碎片MS/MS fragment鑒定結(jié)果Identification result316.77165.055 72165.054 69-2.90C9H9O3MS2[165]:121.064 6(100),106.041 1(19)3-(4-羥基苯基)丙酸326.79173.081 93173.080 93-2.62C8H13O4MS2[173]:111.080 2(100),146.986 3(58)辛二酸336.87174.056 05174.055 07-2.49C10H8O2NMS2[174]:146.960 1(100),130.065 0(80),111.080 2(60)吲哚-3-乙酸347.02193.050 63193.049 82-4.21C10H9O4MS2[193]:178.026 1(100),134.036 1(86), 149.059 6(42),137.023 1(16)阿魏酸358.41137.024 42137.023 27-8.37C7H5O3MS2[137]:93.033 4(100)水楊酸368.71187.097 58187.096 59-5.30C9H15O4MS2[187]:125.095 9(100),146.986 3(52)壬二酸3710.93263.128 88263.128 85-0.12C15H19O4MS2[263]:219.138 4(100),201.127 6(65),151.075 3(46),152.083 0(32),139.075 1(22)脫落酸3811.61201.113 23201.112 35-4.39C10H17O4MS2[201]:139.111 6(100),183.101 7(77),146.986 3(51)3-叔丁基丙酸3913.99187.133 97187.133 15-4.37C10H19O3MS2[187]:59.012 4(100),146.986 3(22)10-羥基癸酸4014.58257.175 83257.175 72-0.44C14H25O4MS2[257]:239.164 9(100),195.174 7(39)十四烷二酸

3.3 化學(xué)成分鑒定

化合物2～4、8、11～12、18、20、24～25、28～29、32、34～37和40的保留時間分別為0.95、0.96、0.97、1.24、1.56、1.69、3.59、4.17、5.03、5.33、5.85、6.41、6.79、7.02、8.41、8.71、10.93、14.58 min，通過與對照品的保留時間，高分辨質(zhì)譜，碎片離子比對，準(zhǔn)確鑒定為酒石酸、L-(-)-蘋果酸、檸檬酸、順式烏頭酸、沒食子酸、檸康酸、N-乙酰纈氨酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、間苯二甲酸、4-香豆酸、辛二酸、阿魏酸、水楊酸、壬二酸、脫落酸、十四烷二酸。

化合物6和7分別與化合物8(順式烏頭酸)和化合物3(L-(-)-蘋果酸)具有相同的一級和二級質(zhì)譜信息，因此將化合物6和7分別鑒定為反式烏頭酸和D-(+)-蘋果酸。

化合物1的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z195.050 05(C6H11O7，5.00 ppm),二級碎片離子為75.007 3、129.018 1、99.007 5、87.002 4，結(jié)合文獻(xiàn)報道[4]，鑒定為葡萄糖醛酸；化合物5的保留時間為0.99 min，其分子式[M-H]-為C5H5O5(145.013 06，-4.40 ppm)，二級碎片為101.023 1、127.024 0、83.012 5，根據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，鑒定為2-氧戊二酸。

化合物9、19和22的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z188.055 57、203.081 88和164.070 60 [M-H]-，通過與Thermo內(nèi)置的數(shù)據(jù)庫比對，分別鑒定為N-乙酰谷氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。

化合物10的準(zhǔn)分子離子峰為m/z147.065 17[M-H]-，二級碎片離子為m/z129.054 5、101.059 4、59.012 4，并結(jié)合文獻(xiàn)報道[6]，鑒定為甲羥戊酸。

化合物13的準(zhǔn)分子離子峰為m/z191.055 21[M-H]-，產(chǎn)生了m/z101.059 4、115.038 8、129.054 5和145.049 4的二級碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)報道[7]，鑒定為D-(-)-奎寧酸。

化合物14的保留時間為2.50 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z218.102 74[M-H]-，二級碎片為m/z88.039 0和146.081 1，結(jié)合文獻(xiàn)[8]，鑒定為泛酸。

化合物15的準(zhǔn)分子離子峰為m/z153.018 26[M-H]-，通過丟失CO2，形成m/z109.028 2的二級碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報道[9]，鑒定為原兒茶酸。

化合物16的保留時間為3.42 min，產(chǎn)生m/z151.038 96[M-H]-的準(zhǔn)分子離子和m/z121.064 5、107.048 9、123.043 8的二級碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)報道[10]，鑒定為2-羥基苯乙酸。

化合物17的保留時間為3.47 min，產(chǎn)生了m/z375.129 49[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰,以375.129 49[M-H]-為母離子，在其二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z213.075 9是由中性丟失1分子葡萄糖基([M-H-Glc]-)生成的,基峰碎片離子m/z169.085 9對應(yīng)[M-H-Glc-CO2]-,結(jié)合文獻(xiàn)[11]，鑒定為mussaenosidic acid。

化合物21的保留時間為4.34 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z175.060 24[M-H]-，產(chǎn)生了m/z115.038 7的二級碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報道[12]，鑒定為2-異丙基蘋果酸。

化合物23的保留時間為4.92 min，產(chǎn)生m/z181.049 73[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰和m/z135.493 9和163.039 0的二級碎片離子，并結(jié)合文獻(xiàn)報道[13]，鑒定為4-羥基苯乳酸。

化合物26和27的出峰時間為5.59和5.75 min，均得到m/z131.071 37[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，且具有相同的二級碎片離子m/z85.064 5，根據(jù)文獻(xiàn)報道[13]，鑒定為2-羥基己酸的同分異構(gòu)體。

化合物30和31的保留時間分別為6.53和6.77 min，均得到m/z165.054 7[M-H]-的質(zhì)譜信號和二級碎片離子m/z121.064 6，結(jié)合文獻(xiàn)[14]，鑒定為3-(4-羥基苯基)丙酸的同分異構(gòu)體。

化合物33的準(zhǔn)分子離子峰為m/z174.055 07[M-H]-，碎片離子為m/z135.043 9，結(jié)合文獻(xiàn)報道[15]，鑒定為吲哚-3-乙酸。

化合物38的保留時間為11.61 min，產(chǎn)生了m/z201.112 35[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰和m/z139.111 6、183.101 7、146.986 3的二級碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，鑒定為3-叔丁基丙酸。

化合物39的保留時間為13.99 min，準(zhǔn)分子離子為m/z187.133 15[M-H]-，二級碎片離子為m/z59.012 4和146.986 3，根據(jù)文獻(xiàn)報道[17]，鑒定為10-羥基癸酸。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS結(jié)合排除離子列表研究了侗藥馬卡列丙中的化學(xué)成分。排除離子列表可以很好的排除儀器中背景離子和已鑒定的化合物離子的干擾，從而產(chǎn)生更多有用的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)而可以首次從該植物中鑒定更多未報道的化合物。本實(shí)驗(yàn)從侗藥馬卡列丙中鑒定了40個化學(xué)成分，均是從該植物中首次發(fā)現(xiàn)。侗藥馬卡列丙具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、消腫止痛的傳統(tǒng)功效，現(xiàn)代藥理研究表明其主要活性為抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化。相關(guān)研究表明，馬卡列丙中分離得到的麝香草酚、異丁酸百里香酯和綠原酸類成分具有明顯的抗炎和鎮(zhèn)痛作用[3,18]。本研究首次從馬卡列丙中鑒定出的咖啡酸、沒食子酸、水楊酸、奎尼酸、原兒茶酸和香豆酸等化學(xué)成分擁有較強(qiáng)的抗炎活性[19,20]；酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、原兒茶酸和阿魏酸等具有較好的抗菌和抗氧化作用[21,22]。該結(jié)果為闡明馬卡列丙中抗炎和抗氧化的化學(xué)物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，后續(xù)仍需進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證其藥效物質(zhì)。與此同時，排除離子列表在液質(zhì)成分鑒定的應(yīng)用，極大地促進(jìn)了中藥中化學(xué)成分的首次發(fā)現(xiàn)。