史曉杰，朱瑞，祁立波，杜明，于翠平*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034)

傳統(tǒng)高湯一般選用雞、鴨、牛、豬骨等畜禽骨長時(shí)間熬制而成，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、骨膠原、軟骨素等營養(yǎng)物質(zhì)。原料中的畜禽骨作為肉類加工中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量大、價(jià)格低廉、營養(yǎng)價(jià)值高[1,2]。吳素玲等[3]曾探討高湯生產(chǎn)的原料選擇，證明豬筒骨和雞骨架所制得高湯鮮美可口、營養(yǎng)豐富。鴨肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn)[4]。試驗(yàn)以雞骨架、鴨腿、豬筒骨為主料熬制砂鍋魚高湯，燉制砂鍋魚時(shí)加入高湯，高湯與魚風(fēng)味的結(jié)合使味道更加醇厚、鮮美、營養(yǎng)豐富，起到市售調(diào)味品無法替代的作用。固相微萃取(SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)因具有高效、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)性成分的分析測定[5-7]，本試驗(yàn)對(duì)高湯工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用SPME-GC-MS法探究砂鍋魚高湯中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，研究砂鍋魚高湯制作工藝及參數(shù)對(duì)其品質(zhì)影響機(jī)制以及風(fēng)味形成，為未來工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬筒骨、雞架、鴨腿、食鹽、料酒、香料八角、香葉、桂皮、桂圓、陳皮、小茴香、白胡椒等：大連長興市場；C6～C20正構(gòu)烷烴：Sigma公司；酒石酸鉀鈉：生工生物工程有限公司；氫氧化鈉：大連博諾有限公司；牛血清白蛋白(BSA)：北京寶希迪科技有限公司；日立氨基酸自動(dòng)分析儀配套試劑(茚三酮顯色液、pH緩沖液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液)：日立高新技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

美的電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；Agilent 7890 A/5975 C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司；Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS手動(dòng)固相微萃取(SPME)萃取頭 美國Supelco公司；YP6001N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；全自動(dòng)不銹鋼反壓高溫蒸煮鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；LA8080全自動(dòng)氨基酸分析儀 日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 砂鍋魚高湯的工藝流程

豬筒骨、雞骨架、鴨腿→切割破碎→預(yù)處理→加入配料→高溫高壓熬制→湯渣分離→砂鍋高湯。

將一定質(zhì)量的豬筒骨、雞骨架、鴨腿切割成均勻塊狀，冷水下鍋，水沸后煮5 min撈出洗凈雜質(zhì)，按照一定料液比將原配料和水放入鍋中進(jìn)行煮制，將煮制好的高湯冷卻后用紗布過濾3次即可。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 煮制溫度對(duì)砂鍋魚高湯品質(zhì)的影響

確定煮制時(shí)間2 h、料液比1∶3的條件下,將煮制時(shí)間分別設(shè)置為100，105，110，115，120 ℃，考察煮制溫度對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分、游離氨基酸含量、可溶性蛋白含量的影響。

1.3.2.2 煮制時(shí)間對(duì)砂鍋魚高湯品質(zhì)的影響

確定煮制溫度110 ℃、料液比1∶3的條件下,將煮制溫度分別設(shè)置為1.5，2，2.5，3，3.5 h，考察煮制時(shí)間對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分、游離氨基酸含量、可溶性蛋白含量的影響。

1.3.2.3 料液比對(duì)砂鍋魚高湯品質(zhì)的影響

確定煮制時(shí)間2 h、煮制溫度110 ℃的條件下, 將料液比分別設(shè)置為1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5，考察料液比對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分、游離氨基酸含量、可溶性蛋白含量的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

以砂鍋高湯的煮制溫度、煮制時(shí)間、料液比為因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳工藝條件，正交試驗(yàn)的因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 可溶性蛋白含量的測定

高湯冷卻至常溫后用紗布過濾3次去除油脂后，在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，使用雙縮脲法，測定540 nm波長下的吸光值，計(jì)算可溶性蛋白的濃度。

1.3.5 游離氨基酸含量的測定

取砂鍋魚高湯樣品5 mL于15 mL離心管中，在10000 r/min條件下離心10 min，取上清液1 mL，加3 mL丙酮靜置10 min，10000 r/min條件下離心10 min除大蛋白，取上清液體，氮吹除丙酮和水，用1 mL濃度為0.02 mol/L的鹽酸復(fù)溶后，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。

采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量，主要技術(shù)參數(shù)：分析柱 C18正相柱(40 mm×125 mm，5 μm；溫度57 ℃)；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相采用梯度洗脫，洗脫模式見表2(B1、B2、B3、B4、B5、B6為氨基酸分析儀用緩沖液)。

表2 氨基酸分析流動(dòng)相梯度洗脫表Table 2 Gradient elution of mobile phase for amino acid analysis

1.3.6 感官評(píng)價(jià)方法

邀請(qǐng)6名來自不同地區(qū)、對(duì)于食品感官評(píng)價(jià)有一定經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)學(xué)生，感官評(píng)價(jià)在光線充足、安靜、并且室溫穩(wěn)定的感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分別對(duì)不同工藝煮制的高湯進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分采用100分制，按照表3針對(duì)色澤、氣味、滋味和浮油4個(gè)方面對(duì)高湯進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[8,9]。

表3 砂鍋魚高湯感官評(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard for casserole fish stock

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定(SPME-GC-MS分析)

1.3.7.1 SPME-GC-MS分析條件

風(fēng)味物質(zhì)的萃取采用固相微萃取，取5 mL高湯樣品于20 mL萃取瓶中，加蓋后在60 ℃水浴鍋中孵育30 min，將裝有Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣針在GC進(jìn)樣口于250 ℃老化15 min后插入樣品瓶中，推出纖維頭，于60 ℃吸附30 min后移出萃取頭，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，于260 ℃熱解吸5 min，采用GC-MS對(duì)吸附的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析與檢測。

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣為氦氣，柱前壓7.131 psi，載氣流速：1 mL/min，不分流。程序升溫：起始柱溫40 ℃，保留3 min；以5 ℃/min升溫至90 ℃，保留3 min；再以4 ℃/min升至180 ℃，無保留；最后以10 ℃/min升至280 ℃。運(yùn)行時(shí)間為45.5 min，進(jìn)樣口汽化室溫度為260 ℃[10]。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿檢測器溫度150 ℃；采集方式為全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為40～400 m/z。

1.3.7.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性

采用相同的檢測條件對(duì)C7～C30正構(gòu)烷烴進(jìn)行檢測，計(jì)算各未知物的保留指數(shù)，通過保留指數(shù)的篩選，同時(shí)與NIST/EPA/NIH標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(版本2.2)比對(duì)，對(duì)未知化合物進(jìn)行定性分析。保留指數(shù)的計(jì)算公式如下：

式中：RI為保留指數(shù)，X為未知化合物，Z和Z+1分別為未知化合物(X)測出前后的正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目，R(X)、R(Z)、R(Z+1)分別為未知化合物、未知化合物測出前后的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.3.7.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)物為環(huán)己酮，濃度20 μg/mL，加入量50 μL，利用未知物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比等于二者物質(zhì)的量比對(duì)未知化合物進(jìn)行定量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖制表；使用分析軟件SPSS 22.0、Duncan法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 煮制溫度對(duì)砂鍋高湯品質(zhì)的影響

氨基酸是食品中一類重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在食品風(fēng)味的形成過程中發(fā)揮著重要的作用，既是滋味、鮮味的重要來源，也是風(fēng)味形成的前體物質(zhì)，谷氨酸和天冬氨酸是2種主要的能夠呈現(xiàn)鮮味的游離氨基酸，稱為鮮味氨基酸[11-13]。在料液比1∶3、煮制時(shí)間2 h的條件下，不同煮制時(shí)間對(duì)游離氨基酸含量的影響見表4。隨著煮制溫度的升高，游離氨基酸總含量顯著升高，在120 ℃達(dá)到最大值25.34 mg/dL，同樣必需氨基酸含量與EAA/TAA值也在120 ℃達(dá)到最大值。煮制溫度從100 ℃升至120 ℃，谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、組氨酸等氨基酸含量也呈上升趨勢(shì)。

表4 不同熬制溫度的砂鍋魚高湯的游離氨基酸含量Table 4 The free amino acid composition of casserole fish stock prepared at different cooking temperatures

續(xù) 表

注：同一行中標(biāo)注不同的字母a～e表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

圖1 煮制溫度對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of cooking temperature on sensory score of casserole fish stock

由圖1可知，隨著煮制溫度的升高，感官評(píng)分先升高后降低，當(dāng)溫度達(dá)到115 ℃時(shí)，游離氨基酸含量較高，氨基酸對(duì)高湯的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)，此時(shí)感官評(píng)分顯著高于其他溫度，達(dá)到84.83分。

圖2 煮制溫度對(duì)砂鍋魚高湯可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of cooking temperature on soluble protein content in casserole fish stock

由圖2可知，煮制溫度的升高促進(jìn)可溶性蛋白的溶出，故可溶性蛋白含量隨著溫度的升高顯著增加，考慮到高溫煮制能量消耗大，同時(shí)115 ℃與120 ℃對(duì)高湯品質(zhì)影響差異不顯著，綜合考慮，最佳煮制溫度為115 ℃。

2.1.2 煮制時(shí)間對(duì)砂鍋高湯品質(zhì)的影響

在料液比1∶3、煮制溫度110 ℃的條件下，不同煮制時(shí)間對(duì)砂鍋高湯可溶性蛋白含量的影響見圖3。

圖3 煮制時(shí)間對(duì)砂鍋魚高湯可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of cooking time on soluble protein content in casserole fish stock

由圖3可知，隨著煮制時(shí)間的延長，原料中的蛋白質(zhì)不斷溶出，可溶性蛋白含量顯著增加，而3 h以后持續(xù)增加，但增速變緩，主要是由于此時(shí)原料中蛋白含量越來越低，高湯中含量逐漸趨于平衡，同時(shí)蛋白質(zhì)在加熱作用下會(huì)發(fā)生部分降解[14]，此結(jié)果與鄶鵬[15]在研究高湯水溶性蛋白隨熬煮時(shí)間的變化規(guī)律時(shí)結(jié)果一致，張靜妍等在研究加熱時(shí)間對(duì)排骨湯中可溶性蛋白的影響試驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)論。

圖4 煮制時(shí)間對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of cooking time on sensory score of casserole fish stock

由圖4可知，煮制2 h的高湯的感官評(píng)分顯著高于其他時(shí)間，煮制時(shí)間的延長使高湯中的成分相互作用，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，但隨著煮制時(shí)間繼續(xù)延長，高湯的顏色加深，部分風(fēng)味物質(zhì)分解，甚至?xí)a(chǎn)生不良風(fēng)味，使感官評(píng)分降低。

表5 不同熬制時(shí)間的砂鍋魚高湯的游離氨基酸含量Table 5 The free amino acid content of casserole fish stock prepared at different cooking time

注：同一行中標(biāo)注不同的字母 a～e表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

由表5可知，隨著煮制時(shí)間的延長，大多數(shù)游離氨基酸含量隨著煮制時(shí)間的延長呈增加的趨勢(shì),主要是由于加熱過程中蛋白質(zhì)不斷降解成氨基酸，煮制時(shí)間為2.5 h時(shí)，游離氨基酸總含量達(dá)到最大值31.51 mg/dL，當(dāng)加熱時(shí)間繼續(xù)延長，游離氨基酸總含量下降，可能是由于游離氨基酸也會(huì)發(fā)生熱降解以及美拉德反應(yīng)[16]。必需氨基酸 (EAA)含量與EAA/TAA 值變化趨勢(shì)相同，均為先升高后降低，在3 h達(dá)到最大值，但氨基酸含量只是影響高湯品質(zhì)的因素之一，高湯品質(zhì)還受其他眾多因素的影響[17]，綜合考慮，高湯的最佳煮制時(shí)間為2 h。

2.1.3 料液比對(duì)砂鍋高湯品質(zhì)的影響

煮制時(shí)間2 h、煮制溫度110 ℃的條件下，不同料液比對(duì)游離氨基酸含量的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)砂鍋魚高湯感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on sensory score of casserole fish stock

由圖5可知，隨著料液比的增加，游離氨基酸總含量先增加后降低，從1∶1.5～1∶2.5含量增加可能是由于水量較少時(shí)氨基酸未全部溶出，而隨著水量的增加，游離氨基酸的量升高但是被不斷稀釋，故最終濃度不斷減小，類似地，EAA/TAA降低，而鮮味氨基酸的含量反而升高。

圖6 料液比對(duì)砂鍋魚高湯可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to lquid on soluble protein content in casserole fish stock

由圖6可知，可溶性蛋白含量由于加水量的增加顯著降低。感官評(píng)分先增加后降低，變化顯著，在料液比為1∶2.5時(shí)達(dá)到最大值?？赡苁怯捎诋?dāng)料液比較小時(shí)，高湯較濃，色澤深，而當(dāng)料液比增大時(shí)，高湯被不斷稀釋，缺乏鮮味，滋味和香味變淡，故最終確定1∶2.5為最佳煮制料液比。

表6 不同料液比的砂鍋魚高湯的游離氨基酸含量Table 6 The free amino acid content of casserole fish stock prepared at different ratios of solid to liquid

注：同一行中標(biāo)注不同的字母 a～e表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)砂鍋魚高湯工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表7和表8。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal experimental results

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 8 Orthogonal experimental results analysis of variance

注：F0.01(2,2)=99.00，F(xiàn)0.05(2,2)=19.00。

由表7中的R值可知，影響高湯感官評(píng)分的因素主次關(guān)系依次為C>B>A，其中煮制溫度與煮制時(shí)間為極顯著因素(p<0.01)，料液比為顯著因素(p<0.05)，高湯煮制最佳工藝參數(shù)組合為A2B2C2，即煮制溫度115 ℃，煮制時(shí)間2 h，料液比1∶2.5，此工藝參數(shù)煮制的砂鍋魚高湯品質(zhì)最佳。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

A2B2C2組合在正交試驗(yàn)中未出現(xiàn)，不能確定此組合是否為最優(yōu)工藝，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在A2B2C2條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，感官評(píng)分為86.33分，高于其他組合感官評(píng)分，說明煮制溫度115 ℃、煮制時(shí)間2 h、料液比1∶2.5為高湯的最佳工藝。

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

按設(shè)定條件，對(duì)優(yōu)化后的高湯樣品進(jìn)行GC-MS分析，其揮發(fā)性成分總離子流色譜圖見圖 7。已有研究表明湯汁風(fēng)味的形成主要有3個(gè)途徑：一是蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)的熱降解，蛋白質(zhì)降解生成游離氨基酸，在加熱條件下脫氧、脫羧生成揮發(fā)性羰基化合物；二是酯類的氧化作用，生成酯類、烴類、醇類等化合物；三是氨基酸與糖的美拉德反應(yīng)。

圖7 砂鍋魚高湯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of volatile flavor compounds in casserole fish stock

SPME-GC-MS分析結(jié)果見表9。

表9 砂鍋魚高湯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及含量Table 9 The volatile flavor compounds and their content in casserole fish stock

續(xù) 表

由表9可知，共分析鑒定出31種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其中醇類8種(27.33%)、醛類10種(29.13%)、烯類4種(34.53%)、酮類3種(1.28%)、烷烴類2種(1.21%)、酸類2種(4.99%)、芳香類化合物1種(1.20%)、酯類1種(0.34%)。在測得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，醛類、醇類和烯類三大類含量最高。其中醛類物質(zhì)多數(shù)來源于不飽和脂肪酸的氧化和甘油三酯自動(dòng)氧化的降解，醛類對(duì)于高湯風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)，閾值較低，具有脂肪的香味[18,19]，如己醛有油脂、青香、葉香、果香；苯甲醛具有令人愉悅的櫻桃香、杏仁香和堅(jiān)果香，可能來自于添加的香辛料；壬醛具有油炸香、烤焦香和強(qiáng)烈的油脂氣息；(E)-2-壬烯醛具有脂肪氣息、蠟香、黃瓜香和甜瓜香；(E,E)-2,4-癸二烯醛具有脂肪香、雞香；烯類含量較高，茴香烯、欖香烯等主要由茴香、桂皮等香料的添加產(chǎn)生,香辛料提供的烯類物質(zhì)閾值較低，同時(shí)烯烴與烷烴的協(xié)同作用對(duì)于高湯的風(fēng)味也具有重要的貢獻(xiàn)[20]。醇類化合物中包括乙醇，目前并無研究表明肉類煮制產(chǎn)生乙醇，故推測乙醇來源于料酒，桉葉油素具有樟腦樣香氣和清涼味，松油醇具有丁香香氣,同時(shí)其他長鏈醇對(duì)高湯風(fēng)味也有一定程度的貢獻(xiàn)。酮類、烷烴類、酸類、芳香類化合物、酯類雖含量不高，但對(duì)高湯的風(fēng)味也起到不同程度的提升作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了煮制溫度、煮制時(shí)間和料液比對(duì)砂鍋魚高湯品質(zhì)的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)高湯工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為煮制溫度115 ℃，煮制時(shí)間2 h，料液比1∶2.5，此工藝煮制的高湯顏色清澈，具有明顯的肉香與骨香，味道鮮美，回味良好，無明顯浮油，感官評(píng)分達(dá)到86.33分。利用SPME-GC-MS法對(duì)高湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定出31種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類8種、醛類10種、烯類4種、酮類3種、烷烴類2種、酸類2種、芳香類化合物1種、酯類1種。砂鍋魚高湯工藝的優(yōu)化以及揮發(fā)性風(fēng)味的測定為未來的工業(yè)化生產(chǎn)和風(fēng)味調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。