李鈺婷，蔡大可, 鄭柳怡，胡子旋，占心佾，劉昌輝，甘海寧，黃雪君，黃丹娥，陳玉興

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2. 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院， 廣東 廣州 510095；3. 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095；4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所, 廣東 廣州 510405)

高脂血癥是常見的慢性疾病癥狀，以高膽固醇和高甘油三酯為特征，常見于糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝紊亂疾病當(dāng)中。同時，高脂血癥也是動脈粥樣硬化和心腦血管病的危險因素[1]。因此，深入了解機(jī)體脂質(zhì)代謝，特別是肝臟脂質(zhì)代謝機(jī)制和關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，對于開發(fā)降血脂藥物具有創(chuàng)新意義。目前的研究表明，高脂血癥以及炎癥兩者關(guān)系密切，亦互為因果，共同促進(jìn)各類代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3]。換言之，脂質(zhì)代謝紊亂引起的無菌性炎癥，能夠進(jìn)一步引發(fā)脂質(zhì)代謝受阻。點(diǎn)頭樣受體3(NACHT、LRRand PYD domains-containing protein 3,NLRP3)是炎癥小體形成的關(guān)鍵蛋白，能夠被脂質(zhì)代謝紊亂及脂質(zhì)過氧化物觸發(fā)激活[4]；由此可見，NLRP3是脂質(zhì)代謝引發(fā)疾病發(fā)展的關(guān)鍵蛋白，其生物學(xué)意義受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和探討[5]。目前，NLRP3介導(dǎo)的內(nèi)源性炎癥對于肝臟脂質(zhì)代謝的研究越來越深入，已有較多的研究報道NLRP3的激活會導(dǎo)致肝臟細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的紊亂[3,4,6]。膽固醇 7α-羥化酶(cholesterol 7 alpha-hydroxylase，CYP7A1)是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵代謝酶，該代謝酶能夠?qū)⒛懝檀即x轉(zhuǎn)化為膽汁酸，通過外排至腸道代謝體外。由此可見，CYP7A1是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的關(guān)鍵代謝酶，其具有代謝體內(nèi)膽固醇的作用[7]。在臨床研究上，CYP7A1基因突變與血液中低密度脂蛋白和肝臟膽固醇含量過高、膽汁分泌減少等疾病癥狀有密切關(guān)聯(lián)。由此可見，CYP7A1與脂代謝疾病及后續(xù)的心腦血管疾病密切相關(guān)，調(diào)控CYP7A1的藥物也成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注點(diǎn)[8]。但是該代謝酶是否會受到內(nèi)源性炎癥的影響尚未明確。肝臟CYP7A1表達(dá)水平主要受到上游肝X受體(liver X receptor，LXR)的調(diào)控，由于LXR既是藥物調(diào)控靶點(diǎn)，又可能會受NLRP3炎癥小體的干擾。因此，NLRP3炎癥小體能夠干預(yù)調(diào)脂類藥物的藥理作用，換言之，NLRP3是藥物療效的干擾因素，為了促進(jìn)調(diào)脂藥物的研發(fā)，NLRP3炎癥小體是否干預(yù)降血脂藥物的機(jī)制亟需進(jìn)一步闡明。

芹菜素(apigenin)具有抗氧化、抗炎和調(diào)血脂多種藥理作用，提示其在心腦血管疾病中具有一定的科學(xué)探討價值[9]，且其具有調(diào)控LXR/CYP7A1的潛在作用[10]。最新報道表明，劑量為50 mg·kg-1的芹菜素能夠調(diào)控高脂血癥所致的NLRP3相關(guān)信號通路[11]。鑒于NLRP3對于心腦血管疾病有重要意義，該基因是否會影響芹菜素降血脂和抗炎藥理作用值得深入探討。因此，本研究采用低劑量(6.25 mg·kg-1)的芹菜素進(jìn)行野生型(wildtype，WT)和NLRP3基因敲除小鼠(NLRP3-/-)高脂血癥模型進(jìn)行對比研究。鑒于Triton-WR1339(tyloxapol，TWR)急性動物模型具有致炎和致脂質(zhì)代謝紊亂的特點(diǎn)，比較適合本課題的研究需求，所以采用該急性模型驗(yàn)證本研究的科學(xué)假設(shè)。綜上所述，本研究擬通過基因敲除手段，探討炎癥小體關(guān)鍵蛋白NLRP3對芹菜素降血脂藥物降血脂和抗炎作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級野生型(WT)C57BL/6小鼠30只，♀♂各半，6～8周齡， 體質(zhì)量(20±2)g;SPF級 NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠30只，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g。C57BL/6小鼠購自于廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：No.44007200054626；NLRP3-/-小鼠受贈于廣州中醫(yī)藥大學(xué)，在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心自行繁殖(購買合同：VRS18005-1)，實(shí)驗(yàn)操作符合廣東省第二中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理要求及國家相關(guān)法律規(guī)定。

1.2 藥物及試劑芹菜素(成都瑞芬思生物科技有限公司，純度≥98%)；總膽固醇(totalcholesterol，TC)、總甘油三脂(totaltriglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(A110-1-1，南京建成生物工程研究所)；Triton-WR 1339(MKCC6730，USA)；4%組織細(xì)胞固定液(80G001370，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；總RNA提取試劑TRIzon(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(433180409，天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)；EB替代品(北京普利來基因技術(shù)有限公司)；瓊脂糖(111860，Gene Company Ltd)；電泳緩沖液；SYBRgreen試劑盒(TaKaRa，Japan)。

1.3 儀器JJ3000動物電子秤，G&G公司產(chǎn)品；顯微鏡(Olympus DP72)；BS224S電子天平(1/萬)，德國SARTORIUS產(chǎn)品； 5424型小型高速離心機(jī)，德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品；-80 ℃ 超低溫冰箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；Bio-RAD 全自動酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；， IQ5 熒光定量 PCR儀，均購自美國伯樂公司；水平電泳儀,ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)；微波爐。

2 方法

2.1 藥物配置按照小鼠給藥量(200 kg·L-1)稱取相應(yīng)量的Triton WR 1339，加入相應(yīng)量的生理鹽水，用玻璃棒直接攪拌溶解成濃度為120 g·L-1的溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥劑量實(shí)驗(yàn)動物分組：將30只C57BL/6小鼠和30只NLRP3基因敲除小鼠分別隨機(jī)分為3組，每組10只，♀♂各半。分別為正常組(control)、模型組(TWR)、芹菜素組(APG，6.25 g·L-1)。APG組連續(xù)灌胃給藥5 d,其他組小鼠灌胃給予蒸餾水，每天1次。在給藥d3下午除正常組外，均肌肉注射TWR溶液(0.12 g·L-1)，36 h后收集樣本。樣本收集前12 h禁食，在最后1次給藥后1 h，小鼠眼眶取血收集血樣，后處死小鼠，取約50 mg肝臟置于4%組織細(xì)胞固定液中用于HE染色；取約200 mg肝臟置于1.5 mL EP管中用于檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測將血樣離心，10 000 r·min-1,離心5 min，取上清置于1.5 mL EP管中。根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，通過全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

2.4 肝臟組織切片將置于4%組織細(xì)胞固定液的肝臟進(jìn)行切片，包埋，進(jìn)行HE染色，切片在顯微鏡下檢查，觀察肝臟切片病理變化。

2.5 ELISA檢測血清炎癥指標(biāo)根據(jù)ELISA說明書步驟測定血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1B)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量，用全自動酶標(biāo)儀測定D450值，并根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)濃度值。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證NLRP3基因敲除小鼠0.8 g瓊脂糖加入80 mL DNA電泳緩沖液，微波爐加熱1 min，冷卻到50～60 ℃加入EB替代品，將溶液倒入模具制膠，將膠放入電泳槽，在孔中加入NLRP3基因擴(kuò)增后產(chǎn)物，電壓110V電泳30 min。在紫外燈燈下讀取結(jié)果并拍照。

2.7 RT-qPCR法檢測相關(guān)基因的表達(dá)根據(jù)總RNA提取試劑盒步驟提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測各基因的表達(dá)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。序列如Tab 1所示。

Tab 1 Primer sequences for related genes in RT-qPCR

3 結(jié)果

3.1 瓊脂糖水平電泳驗(yàn)證NLRP3基因敲除小鼠由Fig 1可見，與WT小鼠相比較，在200 bp附近，NLRP3-/-小鼠肝臟組織未能擴(kuò)展出明顯的電泳條帶。而WT小鼠肝臟cDNA中能夠擴(kuò)展出相應(yīng)的條帶；該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NLRP3-/-小鼠。

3.2 芹菜素對WT和NLRP3-/-急性高血脂模型小鼠的抗炎作用如Tab 2～4所示，芹菜素明顯降低NLRP3-/-模型血清炎癥相關(guān)指標(biāo)IL-1β、IL-6和MCP-1的含量(P<0.05)，而在WT模型中未見明顯差異。

Fig 1 Agarose electrophoretogram of PCR amplified products

GroupDose/g·L-1IL-1β/ng·L-1WTNLRP3-/-Control-438.04±59.25422.29±28.91TWR-490.93±40.94?450.24±34.31?APG6.25471.15±52.93382.62±17.32#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTWR

GroupDose/g·L-1IL-6/ng·L-1WTNLRP3-/-Control-68.46±6.9674.62±4.55TWR-84.19±10.40?89.93±11.29?APG6.2584.7275.29±9.61#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05P<0.01vsTWR

GroupDose/g·L-1MCP-1/ng·L-1WTNLRP3-/-Control-268.07±31.56263.09±39.63TWR-296.32±42.03?297.43±62.91?APG6.25255.31±38.42198.65±40.01##

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsTWR

3.3 芹菜素對WT和NLRP3-/-急性高血脂模型小鼠的降血脂作用如Fig 2所示，TWR顯著性地升高兩個模型的血脂水平(P<0.01)，且在NLRP3-/-模型中，芹菜素可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，明顯降低血清中TC、TG、LDL-C的含量(P<0.05),升高HDL-C的含量(P<0.05)。但在WT模型組并未見明顯變化。

3.4 芹菜素對WT和NLRP3-/-急性高血脂模型小鼠肝臟病理的影響如Fig 3所示，TWR可導(dǎo)致WT模型和NLRP3-/-模型小鼠肝臟細(xì)胞排列不規(guī)律，細(xì)胞空泡樣病變，炎性細(xì)胞浸潤等變化；但在給予芹菜素后，NLRP3-/-模型小鼠的肝臟細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞空泡樣病變和炎性細(xì)胞浸潤均明顯減少。

Fig 2 Effect of APG on serum IL-1β, IL-6, HDL-C and LDL-C in WT and NLRP3-/-

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTWR

Fig 3 Effect of APG on hepatic pathology in WT and NLRP3-/- mice

3.5 芹菜素對WT和NLRP3-/-急性高血脂模型小鼠肝臟炎癥及脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的調(diào)控如Fig 4所示，TWR明顯升高兩個模型炎癥相關(guān)因子和降低脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；在給予芹菜素后， 明顯降低NLRP3-/-模型小鼠肝臟中IL-4、ASC、FGF21和升高CYP7A1、vLDLR和CD36的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；而在WT模型中，芹菜素僅降低ASC和升高vLDLR、CD36的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，對IL-4、FGF21和CYP7A1并無明顯作用。

Fig 4 Effect of APG on hepatic mRNA expression of inflammation and lipid metabolism in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTWR

4 討論

芹菜素作為國內(nèi)外學(xué)者研究報道較多的化合物，具有多種藥理活性及調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特點(diǎn)，特別是調(diào)血脂及抗炎的藥理作用，被應(yīng)用于闡述其治療代謝性疾病的關(guān)鍵機(jī)制。但是對于其確切的療效和優(yōu)越性，目前仍存在著較多的爭議。本研究分別采用TWR致高脂血癥WT和NLRP3-/-小鼠模型，對低劑量的芹菜素(6.25 mg·kg-1)呈現(xiàn)差異性的作用。低劑量的芹菜素只有在NLRP3敲除小鼠才能呈現(xiàn)顯著的降血脂及抗炎作用，說明NLRP3或者其生理功能干預(yù)低劑量芹菜素的降血脂藥效。鑒于炎癥與降脂藥物調(diào)血脂作用有相互作用，NLRP3介導(dǎo)的炎癥及纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)對負(fù)性調(diào)控芹菜素藥效有關(guān)。

相對已有文獻(xiàn)報道，本研究采用的芹菜素(6.25 mg·kg-1)為較低的給藥劑量，所以對TWR所致的高脂血癥模型的降血脂作用并不顯著。PCR結(jié)果提示，雖然該劑量對肝臟攝取脂蛋白(如極低密度脂蛋白受體，vLDLR)和膽汁酸外排相關(guān)的基因(如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36)都有上調(diào)作用，但卻未能改善TWR所致血清中高TC和高TG。芹菜素未能恢復(fù)造模所致的膽固醇關(guān)鍵代謝酶CYP7A1表達(dá)抑制，鑒于CYP7A1在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)中關(guān)鍵的脂質(zhì)代謝酶，能夠?qū)⒛懝檀即x為膽汁酸，促進(jìn)血脂膽固醇在肝臟代謝并以膽汁酸排到腸。因此，CYP7A1的表達(dá)抑制導(dǎo)致其降血脂作用受到一定程度上的限制。在NLRP3敲除后，芹菜素能夠上調(diào)模型所致的CYP7A1的表達(dá)，同時呈現(xiàn)顯著的降血脂作用。這些結(jié)果充分說明，CYP7A1的表達(dá)水平或其活性與芹菜素降脂作用有密切相關(guān)。反之，芹菜素調(diào)控CYP7A1的作用會被NLRP3介導(dǎo)炎癥小體抵消。NLRP3介導(dǎo)的炎癥小體很可能通過肝臟固有免疫細(xì)胞(例如kupffe細(xì)胞)，從而影響肝細(xì)胞的脂代謝功能。具體而言，固有免疫細(xì)胞通過NLRP3分泌細(xì)胞因子，包括本研究促炎因子(MCP-1、IL-1B、IL-6)和抗炎調(diào)控因子(IL-4)，影響CYP7A1的轉(zhuǎn)錄水平及藥物調(diào)控作用。芹菜素具有多種藥理作用，具有降血脂作用是當(dāng)中一個藥理活性，但由于其對多種脂質(zhì)代謝靶點(diǎn)(膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程)的調(diào)控作用不強(qiáng)，其作用會受到機(jī)體其他因素(例如炎癥、內(nèi)源性代謝物FGF21)的影響，使得其藥效未能如非諾貝特類或者他汀類降脂藥物的明顯。本研究的結(jié)果提示，對NLRP3具有一定抑制作用的天然化合物與芹菜素配伍，可能發(fā)揮藥物的協(xié)同增效作用，從而體現(xiàn)中藥多成分的優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)[12]，NLRP3基因敲除后，芹菜素下調(diào)成纖維生長因子21(FGF21)表達(dá)水平，同時上調(diào)CYP7A1的表達(dá)。芹菜素對于這兩個基因的調(diào)控僅在NLRP3敲除模型可見，一方面說明NLRP3對于CYP7A1的調(diào)控屬于負(fù)性調(diào)控機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道一致。另外一方面，低劑量的芹菜素未能抵消Triton-1339W所致的NLRP3激活，導(dǎo)致在WT模型小鼠無明顯的降血脂效果。因此，我們推測NLRP3的激活、FGF21的分泌以及CYP7A1表達(dá)抑制主要是由肝臟固有免疫細(xì)胞Kupffer細(xì)胞通過NLRP3信號通路分泌炎癥因子及FGF21類激素物質(zhì)[13]，進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、炎癥、修復(fù)的發(fā)生。因此，調(diào)控Kupffer細(xì)胞免疫中的NLRP3將是調(diào)脂藥物和消除炎癥的新靶點(diǎn)。

本研究僅限于對NLRP3敲除基因后芹菜素降血脂藥效、抗炎及調(diào)控CYP7A1的轉(zhuǎn)錄水平的探討，繼而初步驗(yàn)證NLRP3在芹菜素藥效的干預(yù)作用，但是具體參與調(diào)控細(xì)胞以及NLRP3相關(guān)的機(jī)制還有待深入挖掘。