王莎，劉斯琪，丁鵬敏，龐月笙，陶志，王如峰

（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488）

廣義的藥物代謝，也就是藥物的體內過程，是指機體對藥物的處置過程，包括吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和排泄（excretion）4 個階段。代謝使藥物的結構發(fā)生變化，導致其活化、失活、解毒或增毒，因此，藥物代謝對藥效和毒性有重要影響[1]。藥物代謝研究在提高藥物療效、安全合理用藥、新藥研發(fā)等方面的意義不可忽視。中藥由于其成分復雜，療效和毒副作用受代謝過程的影響更大，其中涉及化學成分的修飾、成分之間以及成分與人體內原有物質的相互作用等。通過追蹤中藥成分的體內過程，結合藥理活性研究，可以發(fā)現(xiàn)和辨識中藥的有效成分，有助于闡明藥效物質及其作用機制。中藥成分代謝研究分動物體內實驗和體外模擬實驗2 種方式。動物體內實驗直接采用活體動物作為研究載體，其研究結果更接近中藥成分在人體內的真實情況。然而，由于動物體內過程的影響因素較多，體內成分及其代謝產物微量，現(xiàn)有檢測和分析技術的局限性，以及種屬差異導致的代謝途徑和代謝酶的差異等，限制了其在中藥代謝特別是代謝機制研究中的應用。但是，體外模擬實驗可以通過組合藥物代謝模型模擬中藥成分在動物體內的代謝過程，再結合藥理活性實驗，發(fā)現(xiàn)活性代謝產物并闡明其作用機制，彌補動物體內實驗的不足。

體外模型通常具有替代（replacement）、簡化（reduction）、精準（refinement）等特點[2]。首先，用體外研究替代動物體內研究能降低成本、簡化操作、精確控制。其次，體外研究排除了體內復雜因素的影響，避免了動物個體差異，對藥效物質及其作用機制的研究更加精確。再次，體外研究可通過大規(guī)模培養(yǎng)得到足量代謝產物，用于準確結構鑒定和藥理活性研究。最后，通過體外研究還可預測和完善體內研究的結果，兩者為互補關系。但是，需要對體外模型進行標準化，以便最大程度地模擬生物體內的實際狀況。不同體外模型也各有其特點和局限性，在中藥代謝研究中應有選擇地使用。

1 體外吸收模型及其應用

口服藥物的主要吸收場所是小腸，其研究方法分為體外（in vitro）、原位（in situ）和體內（in vivo）法。目前藥物腸吸收的體外研究方法主要有2 類，一類是通過分離動物腸黏膜或腸段來評價藥物腸吸收，另一類是通過分離人腸細胞并給予模擬的腸環(huán)境來分析藥物的腸吸收。常用的體外腸吸收模型有大鼠腸囊模型和細胞培養(yǎng)模型，另外還包括尤斯灌流室模型（Ussing chamber）、平行人工膜滲透模型（parallel artificial membrane permeability analysis，PAMPA）、溶出/吸收仿生系統(tǒng)模型（drug dissolution and absorption simulating system，DDASS）等。

1.1 常用的體外吸收模型

1.1.1 大鼠腸囊模型

大鼠腸囊模型包括外翻腸囊模型和非外翻腸囊模型。前者應用較多，后者由于腸囊內部空間狹小、通氣條件不易控制、滲透到外測的藥物濃度低導致檢測困難等原因而應用較少。外翻腸囊模型被用于胃腸段的藥物吸收、代謝、外排轉運、多藥耐藥性以及藥物相互作用等研究。該模型的優(yōu)點是吸收表面積較大和存在黏液層；其缺陷在于：翻轉小腸時易造成形態(tài)破壞，因缺乏血液供應易導致全腸段失活，只能觀察藥物透過腸壁的濃度，無法計算較詳盡的吸收動力學參數(shù)等。

外翻腸囊模型適合于藥物的分段吸收研究，例如在十二指腸、空腸、回腸和結腸的吸收。根據(jù)采用該模型進行的研究結果，中藥成分大部分在十二指腸和空腸被吸收，少部分在回腸被吸收，極少部分在結腸被吸收[3-5]。外翻腸囊模型也可作為一種預測中藥有效成分的工具，有學者采用該模型研究了吳茱萸湯的吸收成分，結合藥效學結果推測吳茱萸堿和吳茱萸次堿是吳茱萸湯治療偏頭痛的有效成分[6]。

1.1.2 細胞培養(yǎng)模型

研究藥物吸收的細胞模型較多，主要包括Caco-2、HT29-MTX、MDCK、MDCK-MDR1 等。

1.1.2.1 Caco-2 細胞模型 Caco-2 細胞系來源于人結腸腺癌（human colon adenocarcinoma）上皮細胞，它在體外培養(yǎng)過程中可以自行分化成單層細胞，在形態(tài)學、標志酶的功能表達以及滲透性等方面與人成熟的小腸上皮細胞類似。Caco-2 細胞模型在20 世紀80 年代后期建立，是首個被國外制藥企業(yè)和實驗室推廣的腸吸收細胞模型，2002 年被國際認定為動物實驗替代方法，現(xiàn)在已被廣泛應用于藥物的腸吸收研究[7]。該模型用帶聚碳酸酯膜的Transwell 孔板構建，筆者團隊發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)基DMEM 比基礎培養(yǎng)基MEM 更適合該模型[8]。楊秀偉等[9]對細胞培養(yǎng)、種板、相關指標檢測等研究后制定了Caco-2 細胞模型標準操作規(guī)程（SOP）。

Caco-2 細胞可自發(fā)進行上皮樣分化且可形成緊密連接，形成腸腔側（頂端絨毛面）和腸壁側（底端基底面），并表達刷狀緣肽酶、某些細胞色素酶和異構酶，這些特點使其適用于吸收特性和機制研究。筆者團隊采用該模型研究了金蓮花化學成分的腸吸收，發(fā)現(xiàn)酚酸類和生物堿類比黃酮類更易被吸收，并且黃酮類的吸收機制與其母核C-7、C-2 和C-3 位上的取代基有關[10-12]。然而，由于Caco-2 細胞來源于人的結腸癌，仍與小腸黏膜存在差異，例如Caco-2 細胞單層缺少黏液層，代謝酶組成和外排轉運體數(shù)量也與小腸黏膜有區(qū)別。鑒于此，有研究者對Caco-2 細胞模型進行了改進和完善，Lozoya-Agullo 等[13]將 Caco-2/HT29-MTX 共培養(yǎng)、Caco-2/HT29-MTX/Raji-B 三重培養(yǎng)并用模型藥物進行驗證，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)、三重培養(yǎng)模型更適合藥物的轉運機制研究。鄧旭東[14]將Caco-2 細胞培養(yǎng)于聚醚砜（PES）中空纖維內，構建了一種新型的中空纖維反應器，細胞在7 d 內完成功能分化，其藥物吸收、轉運能力與傳統(tǒng)Caco-2 模型相當。

1.1.2.2 HT29-MTX 細胞模型 HT29-MTX 細胞模型是HT29 細胞系（來源于人結腸癌細胞）與甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）共培養(yǎng)后形成。該模型含有分泌黏蛋白的杯狀細胞，可模擬小腸的黏液層，用于研究腸黏液對被吸收藥物的影響。與Caco-2 細胞相比，HT29-MTX 中的杯狀細胞增強了對親脂性化合物的吸收[15]。Gagnon 等[16]對Caco-2、HT-29、HT29-MTX 細胞模型進行了比較研究，證明HT29-MTX 細胞模型比較適合于細胞與病原體的相互作用研究。

1.1.2.3 MDCK 細胞模型 MDCK 細胞系來源于馬丁達比犬腎上皮細胞，由Madin S H 和Darby N B于1958 年從成年雄性西班牙獵犬的腎臟獲取[17]。MDCK 接種于 Transwell 半透膜上 2 ～ 6 d 即能分化成柱狀單層上皮細胞并形成致密連接，是較為理想的上皮細胞系[18]。在主動吸收藥物的滲透性研究中，MDCK 細胞模型的表觀滲透系數(shù)（Papp）與Caco-2 細胞模型的Papp有良好相關性，兩者包含的外排轉運體及攝取轉運體區(qū)別較大[19]。綜合比較而言，MDCK 細胞模型更適用于快速膜通透性篩選，也常用作血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）模型。MDCK-MDR1 是利用基因轉染技術將多藥耐藥基因 1（multidrug resistance gene 1，MDR1）轉染至MDCK 細胞所建立的穩(wěn)定高表達人源P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的細胞系。將MDCKMDR1 細胞接種于Transwell 的聚碳酸酯膜上生長形成極化的細胞層，可作為研究藥物雙向轉運、快速篩選、轉運機制和預測體內吸收的模型[20]。胡亞等[21]通過MDCK-MDR1 細胞模型研究了馬錢子生物堿類成分的轉運機制，發(fā)現(xiàn)馬錢子堿、士的寧的吸收以被動轉運為主，可能是P-gp 的底物。

綜上所述，細胞模型在藥物腸吸收研究中應用相對較多，不同細胞培養(yǎng)模型適用范圍不同（見表1），在具體應用中可根據(jù)研究目的靈活選擇。

表1 藥物腸吸收細胞模型比較Table 1 Comparison of drug intestinal absorption cell models

1.1.3 尤斯灌流室模型

尤斯灌流室模型由Ussing 于1951 年提出，經過多年發(fā)展已應用于藥物吸收、物質轉運等多種研究領域。該模型操作簡捷，可對藥物腸段特定位置的吸收與分泌過程，以及藥物轉運的不同階段進行研究[25]。通過微電極檢測細胞膜的電生理變化，該模型可測量藥物在上皮細胞及脈絡膜中的轉運。該模型既可采用動物的上皮組織細胞，也可采用培養(yǎng)的上皮細胞，適合研究藥物的吸收特性和動力學，常用于吸收成分的初篩。李明華等[26]采用該模型發(fā)現(xiàn)，京大戟提取物與紫杉醇合用能提高紫杉醇的生物利用度。另有研究者采用該模型研究了兩色金雞菊4 種代表成分在大鼠腸道中的吸收，發(fā)現(xiàn)這4 種成分均可被吸收[27]。尤斯灌流室也可以與樣品前處理和檢測設備在線串聯(lián)，例如尤斯灌流室-固相萃取-高效液相色譜（Ussing chamber-SPE-HPLC）平臺，可提高活性成分的篩選效率[28]。

1.1.4 其他腸吸收體外模型

其他腸吸收體外模型有PAMPA、DDASS 等。PAMPA 將人造磷脂作為生物膜模擬藥物吸收轉運，對藥物膜透過進行研究。該模型能進行高通量藥物測定，成本低、靈活性好、檢測方便快捷[29]，但是，只能檢測以被動擴散為吸收方式的藥物。DDASS 將藥物體外溶出模型和跨膜透過模型有機結合，可用于表征藥物變化規(guī)律的動力學特點，闡明不同生理狀況對藥物釋放度和吸收率的影響[30]。

1.2 體外吸收模型在中藥研究中的應用概況

對于中藥及其復方研究而言，體外吸收模型是降低研究復雜性、簡化實驗步驟的一種有效手段，也可以視作有效成分的初篩工具。目前，中藥成分腸吸收研究集中在判斷化學成分的吸收難易程度、吸收機制以及吸收過程中的相互作用等方面。其中，重點關注的是活性成分的吸收難易或吸收后含量高的成分，而對于中藥復方的整體腸吸收研究較少且欠深入。這主要是由于中藥及其復方成分復雜，檢測手段難以滿足所致。然而，中藥是多種成分的復合體，微量成分的療效貢獻現(xiàn)在還沒有定論，僅關注主要成分是否能準確反映中藥的真實藥效有待進一步考察。

多種體外模型聯(lián)用是目前中藥體外腸吸收研究的有效方式，因為各種模型來源不同，在細胞組織特性、轉運體的種類和數(shù)量方面與真實小腸黏膜存在差異。多模型聯(lián)用可以相互補充，更接近真實的藥物吸收轉運過程。筆者團隊通過外翻腸囊模型、Caco-2 細胞模型對金蓮花的有效成分進行了研究，結果證明除了黃酮類之外，酚酸類和生物堿類也是金蓮花的主要體內活性成分[31]。有研究者通過體外-生物信息學-體內（in vitro-in silico-in vivo）聯(lián)合策略研究了梔子大黃湯的吸收特性及不同組分的相互作用，明確了湯劑的吸收成分，并證明不同成分間存在相互作用[32]。

2 體外分布模型及其應用

藥物被吸收后，以游離狀態(tài)或結合狀態(tài)隨血液循環(huán)分布到各組織間液和細胞內液。在藥物分布過程中，會受到各種屏障如BBB 和胎盤屏障（placental barrier）的阻礙，藥物透過這些屏障的能力是影響其分布的重要因素。

2.1 常用的體外分布模型

目前，藥物體外分布模型研究中較為成熟的是BBB 體外模型，研究BBB 對藥物分子的透過作用有助于中樞神經系統(tǒng)藥物的篩選和開發(fā)[33]。目前已建立了多種BBB 體外模型，例如Transwell 模型、永生化內皮細胞模型、三維（3D）微流體模型、微流控芯片模型等。

2.1.1 Transwell 培養(yǎng)模型

Transwell 培養(yǎng)模型可分為單細胞培養(yǎng)Transwell模型、共培養(yǎng)Transwell 模型、三培養(yǎng)Transwell 模型。單細胞培養(yǎng)Transwell 模型是最簡單的BBB 體外模型，通過在靜態(tài)條件下，將單層腦毛細血管內皮細胞培養(yǎng)于可滲透支架上而得到。該模型比較穩(wěn)定、成本低、允許細胞遷移，但缺少與周圍細胞群之間的信號轉導，并且靜態(tài)培養(yǎng)無法模擬體內BBB的血流、剪切力等[34]。為彌補單細胞培養(yǎng)的不足，共培養(yǎng)模型將星形膠質細胞與腦血管內皮細胞共同培養(yǎng)，形成的屏障作用更加緊密。三培養(yǎng)模型是將神經元、星形膠質細胞與周細胞進行共培養(yǎng)。三培養(yǎng)Transwell 模型跨內皮細胞電阻明顯升高，緊密連接蛋白表達增強，與體內環(huán)境更相似[35]。

2.1.2 永生化內皮細胞模型

永生化細胞是能保留親代細胞特性且增殖能力強的細胞。Rahman 等[36]總結了36 種利用永生化內皮細胞建立的BBB 模型，應用較廣的是人腦微血管內皮細胞系hCMEC/D3、大鼠腦血管內皮細胞系RBE4 和小鼠腦微血管內皮細胞系bEnd.3。hCMEC/D3 能夠表達細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）、P-gp、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等多種酶或轉運體。RBE4 可表達幾乎所有腦微血管內皮細胞的特征標志物，應用于神經內分泌因子及藥物轉運機制的研究[37]。Cecchelli 等[38]建立了一種由臍帶血造血干細胞分化出的人腦內皮細胞與周細胞共培養(yǎng)的BBB 模型，該模型穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，具有良好的體內外相關性。

2.1.3 3D 微流體模型

微流體模型是基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）的模型系統(tǒng)，目前已構建出多種微流體BBB 模型[39]。其中一種利用PDMS 制作了由微通道相互連接的16 個獨立功能單元，每個功能單元由4 個均一的BBB 模型組成。另一種是將2 個微通道彼此獨立地進行共培養(yǎng)，分別作為BBB 外部和內部的微環(huán)境。此外，還有三層PDMS 加上分隔2 個腔室的PC 膜及微流體芯片等多種模型。其中，微流體芯片模型在BBB 研究中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，該技術通過連接功能單元和通道網絡來操縱微流體，實現(xiàn)微小芯片上的樣品制備、反應、分離、檢測等操作[40]。利用微流控芯片技術構建易調控，接近在體微環(huán)境的體外BBB 模型具有成本低、可控、高通量和可長期監(jiān)測等優(yōu)點[41]。3D 微流體模型不僅將腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞及周細胞等多種細胞以管狀結構包括在內，還考慮到變量因素，如腦皮層毛細血管微血流及內皮細胞間的剪切力。該模型更接近于體內環(huán)境，但是制作成本高，高通量模型制備困難，實驗操作對結果影響較大，并且尚處于早期開發(fā)階段，有待于進一步優(yōu)化。

2.2 體外分布模型在中藥研究中的應用概況

BBB 體外模型在中藥研究中的應用主要涉及2 個方向：一是中藥藥效成分通過抑制病理狀態(tài)下BBB 通透性來發(fā)揮機體保護作用，例如有研究證明黃芪甲苷、芍藥苷通過抑制病理狀態(tài)下BBB 的通透性而發(fā)揮大腦保護作用[42-43]；二是中藥藥效物質促進BBB 通透性而增加藥物透過率，例如冰片、大麻二酚能夠開放BBB，促進其他藥物透過[44-45]。BBB模型在芳香開竅藥的研究中應用廣泛，這類中藥多數(shù)通過影響B(tài)BB 來發(fā)揮作用。王利蘋等[46]總結了冰片、麝香、安息香和石菖蒲等芳香開竅藥對BBB的作用機制：這類中藥“芳香之性走竄”，首先本身易透過BBB；其次能夠“引藥上行”，促進其他藥物透過BBB；再者能夠保護病理狀態(tài)下的BBB。有研究者通過單細胞培養(yǎng)BBB 模型發(fā)現(xiàn)，當葛根素與冰片合用時，冰片可使BBB 通透性增強，促進葛根素進入大腦[47]。湯丹丹等[48]采用共培養(yǎng)模型進一步證明冰片能促進葛根素入腦，發(fā)揮“引藥上行”的作用。

當前的BBB 模型以細胞培養(yǎng)模型為主，在構建模型時除了關注BBB 的結構致密性之外，還要充分考慮藥物轉運體分布的特異性。中藥研究中大部分采用共培養(yǎng)模型，研究者不斷從培養(yǎng)條件、動力學、模型材質等方面加以改進，以期更接近人體BBB。

3 體外代謝模型及其應用

藥物經吸收、分布后，進入代謝器官被代謝。機體主要的代謝器官是肝臟，在胃腸道中也會發(fā)生代謝。體外肝代謝模型在中藥代謝研究中應用廣泛，腸道菌代謝模型在揭示腸道菌、藥物、機體相互作用的研究中被日益重視，胃腸液代謝模型例如人工胃液和人工腸液模型，常用于研究藥物穩(wěn)定性及降解動力學。

3.1 體外肝代謝模型及其應用

肝臟內的藥物代謝主要分為2 個階段：Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝[49]。Ⅰ相代謝主要是引入官能團，脂溶性藥物經氧化、還原、水解、水合等反應生成極性基團，其中涉及的酶主要為CYP 450 酶系。Ⅱ相代謝主要進行結合反應，化合物的極性基團或由Ⅰ相代謝生成的極性基團與內源性極性小分子物質結合，其中涉及的酶主要包括葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGT）、硫酸轉移酶（sulfate transferase，SULT）、谷胱甘肽轉移酶（glutathione S-transferase，GST）等。

3.1.1 常見的體外肝代謝模型

體外肝代謝模型分器官、組織、細胞、亞細胞組分、代謝酶5 個層次，目前應用較多的是肝細胞、肝微粒體、肝S9、肝組織胞質溶膠、基因重組酶系等。其他肝代謝模型還包括精密肝切片（precision-cut liver slices，PCLS）、離體肝臟灌流等。

3.1.1.1 肝細胞模型 肝細胞模型包括原代肝細胞、培養(yǎng)肝細胞和肝癌細胞系模型。原代肝細胞應用最早，以后又發(fā)展出培養(yǎng)肝細胞和肝癌細胞系。

原代肝細胞：來源于正常肝組織的培養(yǎng)物，在藥物研發(fā)領域具有獨特地位并且被廣泛應用，被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）譽為CYP450 酶誘導的“黃金標準”[50]。相對于肝微粒體等亞細胞組分，原代肝細胞有完整的細胞膜，保留了完整的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶系統(tǒng)、輔因子以及藥物轉運體，在藥物代謝研究中表現(xiàn)出良好的體內外相關性，是研究藥物代謝和轉運體相互作用最實用的模型之一。但是，原代肝細胞價格昂貴，在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生表型改變，難以長期保持其原有特性，而且人源肝細胞個體差異大、保存困難，凍融會降低肝細胞的活力和代謝功能，其貼壁能力也會受到影響[51]。Aghdai等[52]用冷凍保存技術對原代肝細胞進行了優(yōu)化，證明凍存時加入二硫蘇糖醇和果糖，能夠增加肝細胞復蘇后的細胞活力和功能。通過對細胞處理條件如細胞凍存、細胞培養(yǎng)技術加以改進，原代肝細胞仍然是研究藥物體內代謝的最佳體外模型[53]。

培養(yǎng)肝細胞：常用的肝細胞培養(yǎng)方法有凝膠包埋培養(yǎng)、聚球體培養(yǎng)以及2D 和3D 培養(yǎng)。肝細胞凝膠包埋培養(yǎng)和聚球體培養(yǎng)均屬于肝細胞組織化培養(yǎng)，兩者的肝細胞存活率及代謝酶活性均高于單層培養(yǎng)，而且聚球體培養(yǎng)高于凝膠包埋培養(yǎng)[54]。在體外藥物代謝及清除率研究中，2D 和3D 培養(yǎng)比常規(guī)培養(yǎng)更具優(yōu)勢。2D 培養(yǎng)是將肝細胞培養(yǎng)于一層固相細胞外基質上，但肝細胞在堅硬的固相物上培養(yǎng)容易導致肝功能快速喪失，而3D 培養(yǎng)則可以規(guī)避該缺點。3D 培養(yǎng)包括多細胞球培養(yǎng)、共培養(yǎng)、肝器官芯片等[55-56]。例如，HepatoPac 是一種人原代肝細胞和小鼠纖維母細胞的共培養(yǎng)模型，可在7 d 內保持肝細胞的代謝功能。Chan 等[57]采用該模型測定了17種成分的體內清除率，證明該共培養(yǎng)模型可精準地預測某些藥物的體內清除率。

永生化肝細胞：因其無限可培養(yǎng)性和表型穩(wěn)定性，永生化肝來源的細胞系已被建議作為原代肝細胞的理想替代模型。但是，永生化肝細胞與原代肝細胞的最大區(qū)別是表達的代謝酶活性較低[58]。人肝源性細胞系包括HepaRG、HepG2、HCC-T 和Hep3B 等。HepaRG 細胞是一種從人肝癌細胞獲取并建立的肝癌細胞系，用二甲基亞砜（DMSO）處理后可進行分化，分化的HepaRG 細胞培養(yǎng)物通常是肝樣細胞（約50% ～ 55%）和膽管樣上皮細胞的混合物[59]。該細胞系中CYP450 酶表達水平和活性明顯弱于原代肝細胞，但是比HepG2 細胞更接近人肝細胞的水平，并且HepaRG 細胞對細胞毒性物質的敏感性高于HepG2 細胞[60]。HepG2 細胞系最初來源于一例15 歲白種人的肝癌組織，其功能特性已被廣泛研究。該細胞系能夠模擬多種肝功能，如血漿蛋白的合成和分泌、膽固醇和三酰甘油代謝、脂蛋白代謝和運輸、膽汁酸合成、糖原合成等。HepG2 細胞系的主要缺點是藥物代謝酶和轉運蛋白的表達有限，大多數(shù)藥物代謝CYP基因表達豐度較低，而且經過長期培養(yǎng)后，該細胞系的蛋白表達水平產生差異，不利于實驗數(shù)據(jù)重現(xiàn)[61]。

3.1.1.2 肝細胞亞組分模型 肝微粒體、肝S9、肝胞質溶膠均屬于肝細胞亞組分，可通過差速離心法制備（見圖1）[62]。

肝微粒體：含有內質網亞細胞組分，包括CYP450 酶和少量Ⅱ相代謝酶。由于其制備過程簡單、易于貯存、重現(xiàn)性好，肝微粒體被廣泛用于藥物代謝及藥物相互作用研究。不同種屬來源的肝微粒體的代謝研究結果存在差異，人肝微粒體應該是最理想的，但是其來源有限。劉文莉等[63]對香柑內酯在7 種不同肝微粒體（人、恒河猴、食蟹猴、豚鼠、大鼠、小鼠、比格犬）中的代謝差異進行了研究，發(fā)現(xiàn)該化合物在比格犬、大鼠、人肝微粒體中的代謝較為接近。一般認為肝微粒體代謝中主要發(fā)生Ⅰ相代謝，Ⅱ相代謝產物很少，這與制備的肝微粒體的轉化效率有關。當肝微粒體轉化效率足夠高時，Ⅱ相代謝產物也經常被檢測到，肝微粒體制備前實驗動物的代謝酶誘導和實驗過程中還原型輔酶系統(tǒng)NADPH 的加入對檢測結果的影響很大[64-65]。

肝S9：肝組織去除勻漿沉淀物后的混懸溶液，其主要特征是含有較多Ⅱ相代謝酶，擁有比較完整的代謝功能，提供的代謝輪廓比肝微粒體更全面。然而，肝S9 的代謝酶活性普遍較低，反應體系靈敏度較差，部分代謝物無法檢測到[66]。肝S9 中膜蛋白（CYP、UGT 和轉運蛋白）濃度低于肝微粒體，但是其中的細胞質或細胞骨架相關蛋白的濃度高于肝微粒體[67]。筆者團隊采用藜蘆酸葡萄糖酯作為底物對肝微粒體和肝S9 代謝進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)肝S9 模型對酯類的代謝能力高于肝微粒體模型[68]。

肝胞質溶膠：肝細胞勻漿經超速離心除去所有細胞器和顆粒后的上清液部分，主要含Ⅱ相代謝酶，Ⅰ相代謝酶較少。肝胞質溶膠所含Ⅰ相代謝酶比肝微粒體少，但Ⅱ相代謝酶多于肝S9，通常應用于單個可溶性酶活性、特定代謝途徑的研究。肝胞質溶膠也可作為肝微粒體的輔助手段來確定藥物代謝途徑[69]。

圖1 差速離心法制備肝細胞亞組分示意圖Figure 1 Schematic diagram of hepatocyte subfractions prepared by differential centrifugation

3.1.1.3 基因重組酶系 基因重組酶系是指利用基因工程及細胞工程方法，將人源的CYP450 或UGT 基因轉染到大腸埃希菌或昆蟲細胞中進行表達后產生的重組酶系。通過該酶系，能夠定性研究酶系中單個亞型對整個代謝反應的相對貢獻和代謝途徑?；蛑亟MCYP450 酶系與肝微粒體實驗關聯(lián)性好，適合對藥物代謝進行微觀化和細節(jié)化的研究[70]。但是，該酶系價格昂貴、成本高，與人體內相同酶的豐度也有較大差異，且用重組酶得到的代謝結果，不能直接外推到人體代謝。

3.1.1.4 其他體外肝代謝模型 精密肝切片應用于肝功能研究始于Krumdieck 切片機的引入[71]，之后van Midwoud 等[72]建立了精密肝切片實時高效液相色譜分析系統(tǒng)（on-line HPLC analysis system）。精密肝切片保留了大部分肝藥酶及細胞器，所有細胞類型均存在，并且有各種細胞類型之間的細胞通訊。但是肝切片活力維持時間僅為5 ～ 7 d，不適于長周期的代謝研究，且切片技術有待進一步提升。該技術現(xiàn)在已被用于藥物代謝和轉運、藥物對酶的抑制或誘導、生物代謝速率動力學等研究[73]，在肝毒性研究中也有報道，有研究者利用該技術發(fā)現(xiàn)何首烏細胞毒成分只有在高濃度時才有肝毒性[74]。離體肝臟灌流是將完整的肝臟置于體外，使用人工方法進行灌注以保持肝臟的組織結構和生理功能，在一定條件下離體肝臟與藥物互相接觸，確定藥物在肝臟中的變化。該模型在器官水平上研究藥物代謝，可以完整地揭示藥物在肝臟中的代謝通路，但是實際操作中需要一定的環(huán)境條件，操作復雜且受時間的限制[75]。

3.1.2 體外肝代謝模型在中藥研究中的應用概況

體外肝代謝模型的每個層次各有其適用范圍，在中藥代謝研究中應用較多的是亞細胞組分模型，例如肝微粒體和肝S9 模型，其中肝微粒體模型應用最多。筆者團隊利用肝微粒體模型研究了金蓮花中黃酮類和酚酸類化合物的肝代謝，發(fā)現(xiàn)這2 類成分既可發(fā)生羥基化、脫烷基等Ⅰ相代謝，又可發(fā)生糖基化、乙?；娶蛳啻x[65-66]。楊秀偉團隊在中藥成分的肝微粒體代謝研究方面也做了大量工作，制備了一系列代謝產物并進行了精準的結構解析[76-77]。汪祺等[78]采用肝微粒體模型研究了何首烏的肝毒性，闡明了大黃素、羥基大黃素等成分通過抑制UGT 1A1 而導致肝毒性的機制。鄭梅等[79]采用肝微粒體模型研究了六味地黃丸與硝苯地平的相互作用，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸與硝苯地平共孵育前后代謝指紋圖譜無明顯差異。

3.2 體外胃腸道代謝模型及其應用

胃腸道特定的酸堿環(huán)境和其中容納的微生物所分泌的代謝酶對化學成分有修飾作用，藥物的胃腸道代謝越來越受到重視。

3.2.1 常用的體外胃腸道代謝模型

體外胃腸道代謝模型主要有腸道菌代謝模型、腸微粒體代謝模型和人工胃腸液模型。

3.2.1.1 腸道菌代謝模型 腸道菌群是人和動物腸道內普遍存在且構成極為復雜的微生物群體，在腸道代謝過程中起重要作用[80]。腸道菌群含有豐富的代謝酶，可催化腸道內化學成分發(fā)生如水解反應、氧化反應、還原反應、含氧化合物向含氮化合物轉化反應、聚合反應等各種反應[81]。腸道菌群中絕大多數(shù)細菌為厭氧菌，需要嚴格的厭氧條件，對環(huán)境的酸堿度、營養(yǎng)物質要求也比較苛刻。構建與體內真實情況最接近、實驗結果重現(xiàn)性好的腸道菌培養(yǎng)模型是體外腸道菌代謝研究的關鍵。常見的腸道菌體外實驗體系有分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、多級連續(xù)培養(yǎng)等。筆者團隊對腸道菌代謝的動力學進行了研究，發(fā)現(xiàn)模型達到穩(wěn)態(tài)需要一個連續(xù)傳代過程，并且腸道菌對底物的代謝過程一般表現(xiàn)為啟動、加速和完成3 個階段，這與其增殖曲線有關[82-83]。楊秀偉等[84]建立了人腸道菌代謝模型的標準操作規(guī)程，對培養(yǎng)基的配制、滅菌，人腸道混合菌株/菌叢的制備，菌株代謝活性篩選等實驗操作進行了標準化。Molly 等[85]基于連續(xù)發(fā)酵模型建立了人腸道微生態(tài)模擬器，該系統(tǒng)由胃、小腸、升結腸、橫結腸、降結腸5 個模擬反應單元組成，研究者利用該反應器研究了不同營養(yǎng)組分對腸道菌群的影響，通過測定菌群數(shù)量、酶活性等指標，證明該模型與人體內數(shù)據(jù)相吻合。隨后有學者設計了電腦控制發(fā)酵系統(tǒng)，通過電腦控制相互連接的單元，使代謝物能在單元間流動[86]。

3.2.1.2 腸微粒體代謝模型 腸微粒體代謝模型是由腸微粒體與藥物在模擬人體生理條件下進行生化反應的體系。腸微粒體可通過差速離心法制備，其CYP450 酶系統(tǒng)可催化多種藥物進行氧化或還原反應。該模型具有制備技術和操作簡單、代謝反應快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，不足之處在于缺乏膜轉運體及部分酶系統(tǒng)[87]。有研究者采用肝、腸微粒體對玳玳果效應組分新橙皮苷、柚皮苷進行了代謝比較，發(fā)現(xiàn)肝是新橙皮苷、柚皮苷的主要代謝部位[88]。某些成分在腸吸收過程中確實會被腸黏膜細胞中的代謝酶代謝，例如槲皮素及其衍生物會被代謝成酚酸等[89]，但由于腸吸收的過程非常短暫，這方面的研究還沒有引起足夠重視。

3.2.1.3 人工胃腸液代謝模型 胃液中含有胃蛋白酶、黏液蛋白，腸液中含有胰蛋白酶、膽汁和腸系膜分泌液，這些物質均可參與藥物代謝?？诜幬镌谖钢信c胃蛋白酶作用，蛋白質被分解成小肽，苷類化合物被代謝為苷元，而酯類化合物可被腸液水解。人工胃腸液模型主要應用于單體成分的胃腸液穩(wěn)定性研究[90-91]，基于藥物在胃腸液的穩(wěn)定性可進一步開展藥物劑型、質量檢測等研究。根據(jù)筆者的經驗，藥物成分在胃腸液中的變化不如預期明顯，這可能與這些成分在胃中停留時間短，腸液pH 比較溫和有關。

3.2.2 胃腸道代謝模型在中藥研究中的應用概況

腸道菌群對中藥成分的代謝有助于其吸收，這方面的研究已成為中藥藥效物質研究中不可忽視的環(huán)節(jié)。筆者團隊開展了一系列研究來幫助明確中藥的藥效物質[31,82,92-94]。然而，不同個體體內的腸道菌群存在差異，由此導致中藥成分在不同個體體內的代謝輪廓不同。例如某些能夠代謝碳苷類化合物的細菌只存在于特定的個體內，導致不同個體對此類成分的生物利用度存在差異[95]。采用體外腸道菌代謝模型最好區(qū)分人種、年齡、性別、體質、飲食習慣、生理和病理狀態(tài)等，需要在這些方面進行深入研究。

近年來隨著腸道菌群研究的不斷升溫，腸道菌代謝模型已被用于腸道菌群結構研究，與代謝組學、宏基因組學、轉錄組學技術相結合，在中藥作用機制研究中取得了不少值得關注的結果。有報道稱，中藥可通過調節(jié)腸道菌群發(fā)揮扶正祛邪作用，有助于腸道疾病、心血管疾病、肝臟疾病及神經性疾病的防治[96]。倪雅麗[97]通過分析代謝組學及腸道微生物表達譜的差異，明確了益智仁對蛋白表達、代謝通路的影響，闡釋了益智仁治療糖尿病腎病的機制。劉永平等[98]對腎病綜合征患者腸道菌群進行了宏基因組學分析，發(fā)現(xiàn)患者的腸道菌群物種多樣性顯著減少。對現(xiàn)有的腸道菌代謝模型加以改造，開展中藥-腸道菌群-人體的相互作用研究可能是未來腸道菌群研究的一個熱點。另外，腸道菌群規(guī)模宏大，其自身代謝產物也會對人體健康產生影響[99]，這方面的研究也值得期待。

4 體外排泄模型及其應用

藥物排泄是指藥物以原形或代謝物的形式，通過排泄器官排出體外的過程。藥物排泄的主要方式為腎臟排泄和膽汁排泄。極性相對較小、相對分子質量小的藥物主要通過腎臟排泄，腎臟中的轉運體對許多內源性或外源性物質的消除有很大貢獻[100]。極性大、相對分子質量大的藥物主要通過膽汁排泄，膽汁排泄以主動轉運為主，一些中藥例如黃連、金銀花、生姜、甘草和赤芍等通過促進膽汁分泌，起到利膽作用[101]。

4.1 常用的體外排泄模型

目前報道的體外藥物排泄模型較少，常用的有離體腎臟灌流（isolated perfused kidney，IPK）模型和肝細胞三明治培養(yǎng)（sandwich-cultured hepatocytes）模型。

4.1.1 離體腎臟灌流模型

IPK 是一種在不受血液循環(huán)系統(tǒng)和神經體液調節(jié)影響的條件下，特異性地對腎臟排泄進行研究的技術。在建立之初，該模型用于腎臟的生理生化功能研究，經過多年發(fā)展，已廣泛應用于藥物的腎臟排泄、代謝、清除研究，也可用于研究藥物之間的相互作用和腎毒性[102]。IPK 的優(yōu)點在于可保留完整腎功能的前提下排除體內復雜因素的干擾，并且可對灌注液蛋白濃度、pH 等多種因素進行控制，能研究不同因素對腎臟功能的影響；其缺陷在于灌注液流速較高以及遠端腎小管功能減弱等[103]。

4.1.2 肝細胞三明治培養(yǎng)模型

肝細胞三明治培養(yǎng)是將新鮮分離或冷凍保存的原代肝細胞接種于2 層基質（下層為膠原，上層為人工基底膜）之間進行培養(yǎng)[104]。三明治結構培養(yǎng)肝細胞可以改善肝細胞的形態(tài)和生存能力，重建體外肝細胞極性，形成極性的基底膜和類膽小管結構，分別介導細胞吸收和膽汁外排[105]。該模型是研究肝膽藥物轉運體功能及其調控的首選體外模型。沈國林等[106]采用該模型研究了P-gp 介導的洛哌丁胺膽汁排泄，發(fā)現(xiàn)洛哌丁胺與P-gp 抑制劑合用可顯著降低洛哌丁胺經膽汁的排泄。

4.2 體外排泄模型在中藥研究中的應用概況

當前中藥成分的排泄研究還主要以動物實驗為主，通過收集動物糞便、尿液或膽汁等方法進行研究。由于體內實驗的影響因素較多，使中藥的排泄研究還相對不夠深入，特別是排泄機制的研究有待加強。采用體外模型進行的相關研究較少，律廣富等[107]應用離體腎臟灌流模型研究了玉米須總黃酮的利尿作用，證明玉米須總黃酮能促進尿酸在腎臟中的排泄，改善尿酸對腎臟的損害。相信未來隨著上述模型的日益完善和新模型的不斷開發(fā)，中藥成分的排泄研究水平會逐漸提升。

5 整體體外代謝模型及其應用

藥物代謝是一個復雜而連續(xù)的過程，前述體外模型只能模擬某一階段或層面的代謝過程，在連貫性和整體性方面與體內研究尚有差別?，F(xiàn)代科學技術的發(fā)展促進了整體體外模型的建立，在近些年產生了一些前沿技術，如多“器官芯片”系統(tǒng)、微流控芯片技術等。

5.1 多“器官芯片”系統(tǒng)

多“器官芯片”系統(tǒng)也被稱為“詢問器（interrogator）”，是將多個人體“器官芯片”集成至一個自動化系統(tǒng)中，生成“器官芯片”平臺，用于體外藥代動力學和藥效學研究。首個“器官芯片”——肺芯片由Huh 等[108]建立，它是一種微流體培養(yǎng)裝置，由透明的柔性聚合物組成，其中包含2 個由多孔膜隔開的平行中空通道，器官特異性細胞培養(yǎng)于其中一個通道的膜的單側，而血管內皮細胞在另一通道培養(yǎng)以重現(xiàn)血管，每個通道均灌注細胞類型特異性培養(yǎng)基。多孔膜允許2 個通道相互連通和進行物質交換，如細胞因子、生長因子、藥物以及由器官特異性代謝產生的代謝產物等[109]。為了驗證該系統(tǒng)是否能夠模擬人體環(huán)境，Herland 等[110]把人的腸道芯片、肝臟芯片和腎臟芯片連接起來，將尼古丁加入系統(tǒng)中模擬口服藥物的代謝過程。由系統(tǒng)得出的尼古丁到達不同組織通道所需的時間、各組織通道中最大尼古丁濃度，以及計算機模擬模型中的肝芯片清除率均與人體用藥之后的測量值非常接近。該研究者還使用肝臟芯片、腎臟芯片和骨髓芯片連接的“器官芯片”裝置對順鉑的藥效學進行了考察，發(fā)現(xiàn)順鉑的肝腎代謝及清除率與順鉑化療患者的相當，而且腎臟芯片中的細胞表達了與化療期間人體腎臟相同的生物損傷標記物，說明多“器官芯片”系統(tǒng)能夠對藥物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性進行精準預測。

5.2 微流控芯片技術

Jie 等[111]自主研發(fā)了雙層微流控芯片，芯片上層蛇形中空纖維內腔接種Caco-2 細胞，模擬腸道藥物吸收和運輸行為；芯片下層接種HepG2 細胞，模擬肝臟進行代謝相關研究。研究者以抗癌藥物染料木素和達卡巴嗪對該微流控芯片進行了測試驗證，證明其可維持細胞的良好代謝能力，可作為有效的代謝模型用于藥物聯(lián)合機制研究。該技術可模擬腸肝行為，與質譜聯(lián)用可分析組合藥物的吸收和代謝。Choucha-Snouber 等[112]建立了肝腎共培養(yǎng)微流體生物芯片模型，以HepG2/C3a 和HepaRG 細胞系模擬肝，以MDCK 細胞系模擬腎，并通過異環(huán)磷酰胺經肝代謝產生腎毒性化合物的代謝過程證明了肝腎共培養(yǎng)模型的可用性。有研究者又進一步建立了腸、肝、皮膚、腎4 種器官共培養(yǎng)芯片，通過對各個模擬器官的功能測定證明了該共培養(yǎng)芯片在28 d 內具有穩(wěn)定的代謝能力[113]。

6 結語與展望

經歷數(shù)十年的發(fā)展，傳統(tǒng)的體外模型日益完備，在中藥代謝研究中發(fā)揮了積極作用。然而，大多數(shù)體外模型是在西藥的代謝研究中建立的，適用于單一或少數(shù)成分的代謝研究。中藥多以復方用藥，成分復雜，代謝產物多種多樣，還存在成分間的相互作用，這些均增加了研究難度，也對體外模型的構建和改良提出了更高要求。第一，需要構建和完善適合中藥特色的體外模型，適應中藥成分體內過程復雜的特點，例如引入放射性同位素示蹤技術等先進的檢測技術，提高檢測的靈敏度和準確性，達到高通量、高內涵、精準和實時檢測的目標。第二，現(xiàn)在的藥物代謝研究已不再單純是中藥成分的代謝產物研究，已經擴展到“組學”范疇，例如代謝組學、基因組學、蛋白質組學，并且與機體的癥候/疾病相聯(lián)系誕生了方證代謝組學，如何建立模擬機體內復雜代謝網絡的體外代謝模型，甚至是病理/癥候代謝模型，是對科研人員的考驗。第三，中醫(yī)藥強調整體觀念，能精準反映體內過程的整體體外模型，例如上文提到的多“器官芯片”系統(tǒng)，微流控芯片技術等對于研究中藥代謝也必不可少。雖然體外藥代模型在中藥研究中的應用尚需改進，但是隨著科學技術的不斷進步，其構建會愈發(fā)完善，研究結果會越來越逼近人體內的真實代謝輪廓，成為研究中藥代謝必不可少的手段。