尤文雅，張亞昆，趙逍遙，王秀伶

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

菊科草本植物牛蒡（Arctium lappaL.）具有藥食同源性。牛蒡根常作菜用或制作牛蒡茶，具有清熱解毒、利尿通便等功效[1]；牛蒡子是牛蒡的干燥成熟果實(shí)，具有疏風(fēng)散熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[2]。牛蒡子為我國傳統(tǒng)中藥，目前報道的牛蒡子的主要生物學(xué)活性包括抗炎[3]、抗癌[4]、抗糖尿病[2]、降血脂[5]、抑菌[6]、抗病毒[7]、止咳[8]、治療便秘[9]、免疫活性[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]、抗腎病[13]、抗老年癡呆[14]、抗過敏[15]、護(hù)肝[16]、抑制K+攣縮[17]等。臨床上，牛蒡子復(fù)方制劑可治療咽炎等上呼吸道炎癥、咳嗽和哮喘等肺部不適以及流感病毒引起的多種疾病。

1 牛蒡子主要活性成分

陳思有等[18]研究顯示，牛蒡子含有木脂素類、揮發(fā)油和油脂類成分，其中木脂素類化合物牛蒡苷（arctiin）和牛蒡苷元（arctigenin）是牛蒡子的主要有效成分。此外，馬天宇等[2]研究顯示，牛蒡子中還含有少量的生物堿、維生素、氨基酸及蛋白質(zhì)等。目前已知，牛蒡苷是中藥牛蒡子的標(biāo)志性成分，牛蒡苷的含量為5.3% ～ 7.3%，平均為6.7%；牛蒡苷元的含量為0.5% ～ 1.5%，平均為0.55%[19]。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，牛蒡子中牛蒡苷含量不得低于5%。然而，不同產(chǎn)地牛蒡子中的牛蒡苷含量相差較大（見表1）。

從目前已有文獻(xiàn)來看，高效液相色譜法是牛蒡苷及牛蒡苷元最主要的檢測方法。米靖宇等[27]對產(chǎn)自黑龍江（哈爾濱）、遼寧（沈陽）、河南（鄭州）、山東（青島）、江蘇（南京、蘇州）、北京、天津、內(nèi)蒙古（呼和浩特）、四川（成都）、云南（昆明）、新疆（石河子）、青海（克拉瑪依）等地的牛蒡子中的牛蒡苷進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量以產(chǎn)地昆明最高（8.02%），產(chǎn)地鄭州的最低（4.07%），其余產(chǎn)地牛蒡苷含量均介于5.47% ～ 7.07%之間。邵晶等[28]對吉林、四川（康定）、河南、甘肅（定西、臨洮、平?jīng)?、和政、慶陽、甘南）等地的牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，除平?jīng)雠］蜃又械呐］蜍蘸枯^低外（3.96%），其余產(chǎn)地牛蒡苷含量在5.86% ～ 7.95%之間。王勁[25]對黑龍江（哈爾濱）、長春、遼寧（燈塔、葫蘆島）、山東（青島）、廣東（廣州）、四川（成都、阿壩、簡陽）、貴州和新疆等地的牛蒡子樣品中的牛蒡苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，這些產(chǎn)地的樣品中牛蒡苷含量均在8%以上。另外，陳思有等[18]對黑龍江（五常）、吉林（梅河口、遼源、通化、延吉）、遼寧（岫巖、寬甸）、內(nèi)蒙古（山民）、重慶、陜西（太白）、甘肅（會川）等不同產(chǎn)地牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡苷元進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，所有樣品中牛蒡苷含量均在13%以上。根據(jù)楊亮蕊等[31]對云南昭通錦屏村、次山鄉(xiāng)、昭陽區(qū)、大理銀橋等4個地區(qū)牛蒡子樣品中牛蒡苷和牛蒡苷元的測定顯示，牛蒡苷的含量極低（0.069 1% ～ 0.153 5%）。目前，有關(guān)影響牛蒡子中牛蒡苷含量的因素尚不清楚。

表1 不同產(chǎn)地牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量比較Table 1 Comparison of arctiin and arctigenin contents in Arctii Fructus from different places

2 牛蒡苷和牛蒡苷元藥代動力學(xué)研究

呂佳[35]對牛蒡苷元在小鼠胃腸道吸收動力學(xué)、家兔體內(nèi)的血漿藥物動力學(xué)以及大鼠臟器分布狀況等進(jìn)行了研究。其中，小鼠胃腸道吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛蒡苷元在胃腸道內(nèi)較為穩(wěn)定；另外，家兔靜脈注射的牛蒡苷元濃度不同，牛蒡苷元在體內(nèi)的消除動力學(xué)也各不相同，靜脈注射低濃度（610 mg · kg-1）時，牛蒡苷元的消除符合線性動力學(xué)模型，而靜脈注射濃度較高時，牛蒡苷元在家兔體內(nèi)消除較快；給大鼠灌胃牛蒡苷元24 h 后檢測發(fā)現(xiàn)，約0.423%的牛蒡苷元從大鼠尿液中排出，0.11%從糞中排出；組織分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛蒡苷元廣泛分布在肝、肺、心、脾、腎等組織中，其中在肝、肺中的含量較高，但在腦組織中未檢測到牛蒡苷元。鄭一敏等[36]用300 mg · kg-1牛蒡苷灌胃大鼠后發(fā)現(xiàn)，其藥物動力學(xué)行為符合二室模型，血漿內(nèi)檢測到牛蒡苷是在經(jīng)口給藥5 min 后，消除現(xiàn)象發(fā)生在30 min 后；牛蒡苷在大鼠肝臟中分布最多，并在心、腎及腦部組織均有分布。類似地，胥秀英等[37]研究結(jié)果顯示，給小鼠灌胃牛蒡子后，牛蒡苷在不同組織分布濃度由高到低順序?yàn)楦?、腎、心、腦。韓舒等[38]研究顯示，給大鼠皮下注射牛蒡苷元（0.3 mg · kg-1）后，在腸、心、肝、胰、腎等組織中均檢測到原形藥物。何斌等[39]對牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示，牛蒡苷元靜脈注射后血藥濃度與時間符合無吸收二室模型，這不同于呂佳[35]報道的家兔靜注牛蒡苷元后其藥代動力學(xué)行為屬無吸收單室模型。袁媛[40]對牛蒡子水提物的藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示，給大鼠灌胃牛蒡子水提物后，在大鼠的尿液和糞便中均檢測到了不同于牛蒡苷元的其他成分。此外，竇德強(qiáng)[41]研究結(jié)果顯示，胃腸道是牛蒡苷的主要代謝器官，而肝沒有參與代謝。

3 牛蒡苷和牛蒡苷元微生物轉(zhuǎn)化研究

3.1 哺乳動物糞樣菌群對牛蒡苷的轉(zhuǎn)化

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，被哺乳動物攝入體內(nèi)的牛蒡苷（1）可被脫糖轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元（2），這是牛蒡苷在機(jī)體內(nèi)發(fā)生的第一步代謝反應(yīng)。Nose 等[42]將底物牛蒡苷與小鼠糞樣菌群共培養(yǎng)24 h 后，在培養(yǎng)物中檢測到了大量牛蒡苷元，表明大部分底物牛蒡苷的4'位葡萄糖基已被脫掉。Wang 等[43]研究結(jié)果再次證實(shí)，小鼠糞樣菌群對牛蒡苷具有脫糖轉(zhuǎn)化作用。除小鼠糞樣菌群外，將人糞樣菌群與牛蒡苷共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，人糞樣菌群同樣可以將底物牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元[44-45]。

除上述脫糖轉(zhuǎn)化外，Nose 等[42]還發(fā)現(xiàn)小鼠糞樣菌群對脫糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物牛蒡苷元具有進(jìn)一步轉(zhuǎn)化能力，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，小鼠糞樣菌群能將底物牛蒡苷元3'位甲基脫去，生成3'-去甲基-牛蒡苷元（3'-desmethylarctigenin，3'-DMAG，3）；由于3'-DMAG 為非天然產(chǎn)物，推測小鼠糞樣菌群分泌的相關(guān)酶類將底物牛蒡苷元脫甲基轉(zhuǎn)化為3'-DMAG。Wang 等[43]研究結(jié)果顯示，除牛蒡苷元和3'-DMAG外，小鼠糞樣菌群轉(zhuǎn)化底物牛蒡苷后的代謝產(chǎn)物還包括3'-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（4）等。除小鼠糞樣菌群外，Heinonen 等[44]于2001 年首次證實(shí)，人糞樣菌群能將底物牛蒡苷轉(zhuǎn)化為多種不同代謝產(chǎn)物，經(jīng)產(chǎn)物分離鑒定發(fā)現(xiàn)，底物牛蒡苷可被人糞樣菌群轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元以及牛蒡苷元去甲基和去羥基產(chǎn)物。2003 年Xie 等[45]從牛蒡苷與人糞樣菌群共培養(yǎng)物中分離得到6 種牛蒡苷的不同代謝產(chǎn)物，即牛蒡苷元、3'-DMAG、3'-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元、3'，3''-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（5）、3'，3''，4''-去甲基-4'-去羥基牛蒡苷元（6）和腸內(nèi)酯（enterolactone，7）；此外，根據(jù)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測了牛蒡苷被人腸道菌群代謝的過程（見圖1）。

圖1 牛蒡苷被人腸道菌群代謝的可能途徑[45]Figure 1 Proposed metabolic pathway of the substrate arctiin by human intestinal flora

3.2 牛蒡苷或牛蒡苷元轉(zhuǎn)化菌株的分離與篩選

2007 年Jin 等[46]將人糞樣菌群與底物牛蒡苷元共培養(yǎng)，首次分離得到一株對牛蒡苷元有轉(zhuǎn)化功能的微生物純培養(yǎng)物，經(jīng)菌種鑒定，將分離得到的純培養(yǎng)物鑒定為厭氧真細(xì)菌屬的一個新分類單元，即菌株Eubacteriumsp. ARC-2。研究結(jié)果顯示，在厭氧環(huán)境下與底物牛蒡苷元共培養(yǎng)62 h 后，菌株ARC-2 能將底物牛蒡苷元轉(zhuǎn)化為二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone）、3'-O-甲基醚二羥基腸內(nèi) 酯（dihydroxyenterolactone 3'-O-methyl ether）、3''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone 3''-O-methyl ether）、4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯（dihydroxyenterolactone 4''-O-methyl ether）、4''-去甲基牛蒡苷元（4''-desmethylarctigenin）、3'-DMAG以及3''-去甲基牛蒡苷元（3''-desmethylarctigenin）等7 種不同代謝產(chǎn)物。僅從高效液相色譜圖所示代謝產(chǎn)物峰的峰面積來看，3''-去甲基牛蒡苷元和4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯這2 種產(chǎn)物的峰面積較大； 通過硅膠柱對產(chǎn)物進(jìn)行分離，并對得到的各代謝產(chǎn)物進(jìn)行量化分析顯示，菌株ARC-2 代謝底物牛蒡苷元后生成的二羥基腸內(nèi)酯和4''-O-甲基醚二羥基腸內(nèi)酯的含量最多。另外，值得一提的是菌株ARC-2 代謝底物牛蒡苷元所生成的7 種代謝產(chǎn)物中并不包括腸內(nèi)酯。

2013 年筆者實(shí)驗(yàn)室從人糞樣菌群中分離得到一株能將底物牛蒡苷或牛蒡苷元高效轉(zhuǎn)化為3'-DMAG的嚴(yán)格厭氧細(xì)菌菌株，經(jīng)菌種鑒定，將分離得到的菌株鑒定為布勞特菌屬（Blautia）的一個新分類單元，并將菌株命名為Blautiasp. AUH-JLD56[47]。2017 年，筆者實(shí)驗(yàn)室以3'-DMAG 為底物，分離得到對3'-DMAG 具有轉(zhuǎn)化功能的單一細(xì)菌菌株Eggerthellasp. AUH-JLD49s，該菌株為嚴(yán)格厭氧細(xì)菌菌株；菌株AUH-JLD49s 在厭氧條件下能將底物3'-DMAG 轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物3'-去甲基-4'-去羥基-牛蒡苷元（3'-desmethyl-4'-dehydroxyarctigenin，DMDHAG）[48]。

腸內(nèi)酯是一種具有類似動物雌激素活性的物質(zhì)，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有手性碳原子，故腸內(nèi)酯為手性化合物（見圖1）。腸內(nèi)酯在自然界中并不存在，只能由木酚素類化合物經(jīng)動物腸道菌群代謝后生成。研究者已分離得到能將油料作物亞麻籽中的木酚素——開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯的特定細(xì)菌菌株[49-50]，然而，已分離得到的菌株代謝SDG 后只生成少量腸內(nèi)酯，大部分產(chǎn)物為腸內(nèi)酯合成的前體物質(zhì)腸二醇。以藥食兩用植物牛蒡子中的標(biāo)志性成分牛蒡苷為底物，利用哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化生成腸內(nèi)酯雖已有報道，但將牛蒡苷轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯的單一微生物菌株目前國內(nèi)外尚鮮見報道。

4 牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的合成與活性研究

李馥睿等[51]2011 年報道了產(chǎn)物3'-DMAG 的化學(xué)合成方法，但由于合成過程需添加有惡臭和強(qiáng)刺激性的吡啶，加之化學(xué)合成反應(yīng)步驟多，所需成本相對較高，目前尚鮮見市場銷售化學(xué)合成的3'-DMAG。迄今，除人工合成的腸內(nèi)酯有銷售外，目前圖1 中涉及的牛蒡苷元的其他代謝產(chǎn)物均鮮見銷售。由于3'-DMAG 及DMDH-AG 等產(chǎn)物匱乏，有關(guān)牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的活性報道目前非常有限。Jin等[52]2013 年利用菌株Eubacteriumsp. ARC-2 在厭氧條件下合成牛蒡苷元的不同代謝產(chǎn)物，并分析牛蒡苷元以及7 個代謝產(chǎn)物與雌激素受體ERα的親和力。結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物對ERα的親和力大小與底物被脫去的甲基的數(shù)目有關(guān)，其中脫掉2 個甲基的代謝產(chǎn)物對ERα的親和力均顯著高于脫掉1 個甲基的代謝產(chǎn)物。

為進(jìn)一步研究牛蒡苷元代謝產(chǎn)物的活性，筆者實(shí)驗(yàn)室通過高效液相色譜法制備了產(chǎn)物3'-DMAG，并對比分析了底物牛蒡苷元和產(chǎn)物3'-DMAG 對DPPH自由基的體外清除能力。結(jié)果顯示，在0.025 ～ 0.100 mmol · L-1范圍時，產(chǎn)物 3'-DMAG 對 DPPH 自由基的清除能力均顯著高于底物牛蒡苷元（P＜ 0.01），但購買的腸內(nèi)酯對DPPH 自由基的體外清除能力明顯較弱[47]。另外，產(chǎn)物3'-DMAG 對人肝癌細(xì)胞株HepG2 具有明顯的體外抑制作用，可影響HepG2 的細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)線粒體內(nèi)凋亡的發(fā)生；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，產(chǎn)物3'-DMAG 顯著抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，且未表現(xiàn)出任何毒性[53]。由于菌株Blautiasp. AUH-JLD56 為嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，制備產(chǎn)物3'-DMAG 必須在嚴(yán)格厭氧環(huán)境下進(jìn)行，而長期維持嚴(yán)格厭氧環(huán)境則需要大量資金投入。為此，筆者實(shí)驗(yàn)室正在對菌株AUH-JLD56 進(jìn)行耐氧馴化嘗試，以期獲得在有空氣氧條件下既能生長，同時又具有轉(zhuǎn)化活性的耐氧突變株。

在牛蒡苷元所有代謝產(chǎn)物中，只有終產(chǎn)物腸內(nèi)酯目前可進(jìn)行人工化學(xué)合成，但由于合成步驟多，且產(chǎn)物純化困難，導(dǎo)致腸內(nèi)酯目前售價較高。在腸內(nèi)酯的生物合成方面，楊東輝等[54]利用哺乳動物腸道菌群轉(zhuǎn)化木酚素為腸二醇和腸內(nèi)酯，哺乳動物腸道菌群經(jīng)傳代50 次后對轉(zhuǎn)化結(jié)果無明顯影響，但不足之處是腸道菌群在厭氧環(huán)境中轉(zhuǎn)化木酚素為腸內(nèi)酯的產(chǎn)率較低（低于30%）。另外，轉(zhuǎn)化SDG為腸內(nèi)酯的單一細(xì)菌菌株雖已有報道，但已報道的菌株轉(zhuǎn)化木酚素為腸內(nèi)酯的能力極低，腸內(nèi)酯尚不能通過已分離得到的菌株進(jìn)行生物合成。目前已知，腸內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)激素平衡、抗氧化、抗癌、降低心血管發(fā)病率、減少骨質(zhì)流失以及緩解脂多糖誘發(fā)性炎癥等多種生理功能[55-57]。腸內(nèi)酯為手性化合物，分布于油料作物亞麻籽中的木酚素SDG 為右旋SDG，經(jīng)哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化后生成的腸內(nèi)酯為右旋腸內(nèi)酯[58-59]；牛蒡子中的牛蒡苷為左旋牛蒡苷，經(jīng)哺乳動物糞樣菌群轉(zhuǎn)化后生成的腸內(nèi)酯為左旋腸內(nèi)酯[59]。由于化合物資源匱乏，有關(guān)右旋腸內(nèi)酯和左旋腸內(nèi)酯在藥理或生理功能上的差異目前尚不清楚。

5 結(jié)語

人體腸道內(nèi)寄居著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物菌群，腸道菌群能否保持平衡對維持人體健康至關(guān)重要。目前已知，日常飲食、長期壓力、行為習(xí)慣以及抗生素使用等多種因素均會對腸道菌群產(chǎn)生影響。湯劑口服劑型為中藥臨床主要使用方式，中藥在機(jī)體代謝的必經(jīng)之路為消化道?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，單一成分、單味中藥和中藥復(fù)方對腸道菌群均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，且調(diào)節(jié)作用主要是通過促進(jìn)有益菌生長和抑制有害菌的過度增殖來實(shí)現(xiàn)，有關(guān)其他方面的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。另一方面，大量研究結(jié)果證實(shí)，腸道菌群中的某些特定菌株對中藥活性成分具有代謝功能，如單味中藥牛蒡子，其主要活性成分經(jīng)人腸道細(xì)菌菌株代謝后可生成7 種不同代謝產(chǎn)物，由于這些代謝物具有不同于底物牛蒡苷元的生物學(xué)活性，中藥本身的藥效將因腸道菌群的代謝而發(fā)生改變。反過來，中藥經(jīng)這些微生物代謝所得產(chǎn)物是否又會繼續(xù)影響人腸道菌群的構(gòu)成或其他方面，目前尚鮮見相關(guān)報道。