劉 剛， 李清月， 汪 沖， 劉曉穎

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230032)

動(dòng)物的生命活動(dòng)都需要大量的能量，不同動(dòng)物雖然食物來源不同，但在體內(nèi)都需要先轉(zhuǎn)化為葡萄糖來提供能量[1-2]。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入需要借助細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose transporters，GLUT)才能得以實(shí)現(xiàn)[3-5]。迄今，被鑒定出來的GLUT共6種，即GLUT1～5和GLUT7，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(glucose transporter type 4，GLUT4)是骨骼肌吸收和利用葡萄糖的關(guān)鍵蛋白，也是目前研究較多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族成員之一。GLUT4 主要分布于骨骼肌細(xì)胞中，是骨骼肌吸收和利用葡萄糖的關(guān)鍵蛋白，與骨骼肌的收縮密切相關(guān)，該蛋白能夠在信號(hào)通路的調(diào)控下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面，參與骨骼肌細(xì)胞跨膜主動(dòng)吸收葡萄糖[5-10]。GLUT4是由包含11個(gè)外顯子的SLC2A4基因進(jìn)行編碼，研究表明，SLC2A4基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的胰島素抵抗以及葡萄糖耐受等不良癥狀，表明GLUT4在動(dòng)物的骨骼肌葡萄糖吸收、血糖穩(wěn)態(tài)維持以及骨骼肌運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮極其重要的作用[11-14]。

鳥類飛翔時(shí)需要消耗骨骼肌產(chǎn)生的大量能量，因此，鳥類不但需要高效的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還需要一個(gè)能夠快速將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的重要介導(dǎo)蛋白[15-16]。大量的生理學(xué)研究表明，GLUT 4是鳥類骨骼肌細(xì)胞吸收葡萄糖的最主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而為鳥類的飛行活動(dòng)提供能量[17-18]。因此，鳥類在飛翔中的高耗能活動(dòng)，能夠促使GLUT 4更加活躍的轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。研究表明，SLC2A4基因及其表達(dá)產(chǎn)物GLUT4在哺乳動(dòng)物中發(fā)生了強(qiáng)烈的進(jìn)化選擇，與其他動(dòng)物相比，鳥類飛翔需要高的能耗，我們推測該基因在鳥類中極可能發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，同時(shí)我們推測SLC2A4基因及其表達(dá)產(chǎn)物GLUT4在善于飛翔的鳥類和不善于飛翔的鳥類中可能發(fā)生不同的適應(yīng)性進(jìn)化[19-20]。本文選取了NCBI上已經(jīng)公開發(fā)表且注釋較完善的17種鳥類SL2A4基因及其編碼的GLUT4作為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)的方法對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、特征、基因進(jìn)化速率及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，探討該基因在不同鳥類類群中是否發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，為鳥類SL2A4基因和GLUT4的進(jìn)一步研究提供有用的信息。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的選取及數(shù)據(jù)來源

為了研究SLC2A4基因及其表達(dá)產(chǎn)物GLUT4在鳥類中的適應(yīng)性進(jìn)化，同時(shí)結(jié)合GenBank上已經(jīng)釋放的注釋完整的數(shù)據(jù)，選取了今鳥亞綱(Neornithes)中的突胸總目(Carinatae)和平胸總目(Ratitae)鳥類為研究對(duì)象(表 1)。研究中的突胸總目主要包括Anseriformes、Columbiformes、Passeriformes和Galliformes等4目14種鳥類，推測該類群鳥類具有較為高效的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)效率。該類鳥類的主要特征為善于飛翔，具有與飛行相關(guān)的生理結(jié)構(gòu)特征：具充氣性骨骼(氣質(zhì)骨)，最后4～6枚尾椎骨愈合成一塊尾綜骨，胸骨具有龍骨突起結(jié)構(gòu)，具有適宜于飛行的發(fā)達(dá)的骨骼肌，肋骨上有鉤狀突起；翼發(fā)達(dá)、正羽發(fā)達(dá)、羽小枝上具小鉤，構(gòu)成羽片。本研究中的突胸總目主要包括Apterygiformes、Struthioniformes和Tinamiformes等3目3種鳥類，推測該類群鳥類的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。該類鳥類主要特征不善于飛翔，生理結(jié)構(gòu)特征主要為翼退化、胸骨不具龍骨突起，不具尾綜骨，羽毛均勻分布、羽枝不具羽小鉤，不形成羽片。平胸總目的著名代表為Apteryxrowi、Dromaiusnovaehollandiae和Nothoproctaperdicaria。本研究中所有物種拉丁名參照整合分類信息系統(tǒng) ITIS(Integrated Taxonomic Information System，www.itis.gov)。下載GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)迄今為止已釋放且注釋較完善的17種鳥類SLC2A4基因序列及其編碼的GLUT4(表 1)。由于SLC2A4基因及其表達(dá)產(chǎn)物GLUT4在模式生物小鼠(Musmusculus)內(nèi)研究較為透徹，另下載小鼠相應(yīng)序列(NM_009204)作為參考進(jìn)行比較研究。

表1本研究物種來源及SLC2A4基因序列的GenBank登錄號(hào)Table 1 Species examined and GenBank Accession No. of SLC2A4 in this study

1.2 SLC2A4基因序列和GLUT4分析

對(duì)從GenBank中下載的SLC2A4基因全長mRNA使用MEGA 7.0分析其堿基組成；GLUT4的理化性質(zhì)主要利用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析，通過SignalP4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號(hào)肽位點(diǎn)；GLUT4的疏水性/親水性通過ExPASy服務(wù)器的ProtScale程序中的K-D法(http://web.expasy.org/protscale)進(jìn)行分析；通過GORIV在線分析平臺(tái)(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)利用在線分析平臺(tái)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行分析。

1.3 進(jìn)化速率分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用PAML軟件包對(duì)SLC2A4基因進(jìn)行選擇壓力分析。使用PAML4軟件中的CODEML程序，采用基于密碼子(codon-based)的分析方法計(jì)算非同義替換率(nonsynonymous substitution，dN)和同義替換率(synonymous substitution，dS)的比率(ω，dN/dS)。ω值是檢測自然選擇的重要參數(shù)，如果ω=1，基因則受中性進(jìn)化(neutral selection)，ω<1時(shí)基因受純化選擇purifying selection)，ω>1則認(rèn)為基因受正選擇(positive selection)。模型的估算輸入的物種樹參考相關(guān)鳥類系統(tǒng)關(guān)系資料，我們選用了以下幾種模型進(jìn)行選擇壓力分析：1)用free-ratio模型估算進(jìn)化樹上每一枝的ω值；2)用two-ratio模型估算前景枝Gallusgallus的ω值(ω1)和背景枝除Gallusgallus外的所有枝的ω值(ω0)。最后對(duì)兩種模型進(jìn)行似然率(Likelihood Ratio Test，LRT)檢驗(yàn)用以判定該模型的統(tǒng)計(jì)方法是否具有顯著性。LRT需要用free-ratio與one-ratio模型、two-ratio與one-ratio模型的似然值之差的二倍去查詢卡平方表來判定是否推翻零假設(shè)(null)而接受備則假設(shè)(alternative)。

為了更好地分析SLC2A4基因在鳥類中的分子進(jìn)化，以小鼠作為外群，以SLC2A4基因編碼的GLUT4作為分子標(biāo)記構(gòu)建17種鳥類的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體方法如下：把所有GLUT4序列用CLUSTALX 2.1進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 7.0軟件轉(zhuǎn)變成進(jìn)行修剪并轉(zhuǎn)換成“.nex”格式文件進(jìn)行數(shù)據(jù)模型選擇，最終選取AIC模式下的模型應(yīng)用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。采用PAUP 4.10軟件構(gòu)建最大似然法(ML樹)系統(tǒng)樹，建樹前先使用Modeltest v 3.7選擇最優(yōu)模型，然后將所得最優(yōu)模型寫入PAUP 4.10軟件命令行中，建樹執(zhí)行快速支持度分析并在一次單獨(dú)的程序運(yùn)行中搜索最佳分值的ML樹的方法，自舉檢驗(yàn)100次。貝葉斯推論法構(gòu)建系統(tǒng)樹(BI樹)用MrBayes 3.1.2軟件建立，建樹前先使用Modeltest v3.7選擇最優(yōu)模型，運(yùn)行4個(gè)馬爾可夫鏈，每100代抽樣1次，運(yùn)行100萬代，去除老化樣本。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLC2A4基因的核苷酸序列分析

17種鳥類SLC2A4基因序列長度在990～1719 bp之間，平均長度為1446 bp，其中最短的為Parusmajor，最長的為Coturnixjaponica(表2)。SLC2A4基因的AT含量在26.0%～53.3%之間，GC 含量在46.7%～74.0%之間(表2)。

2.2 GLUT4分析

17種鳥類的SLC2A4基因編碼的GLUT4進(jìn)行分析，其長度在329～572 AA之間，平均長度為481 AA，其中最短的是Parusmajor，最長的為Coturnixjaponica。GLUT4序列信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在氨基酸序列的第11位與21位之間，Gallusgallus位于第48位，而Parusmajor位于第57位。在17種鳥類中，GLUT4分子質(zhì)量在 35 424.4～59 310.9之間，平均分子量為52 550.89；等電點(diǎn)在5.09～9.58之間，平均等電點(diǎn)為6.53；不穩(wěn)定指數(shù)在38.52～79.99之間。在鳥類中所有GLUT4分子為親水性蛋白，總平均疏水性-0.54～-0.285之間(表3)。通過對(duì)GLUT4蛋白分子糖基化位點(diǎn)分析表明，N-糖基化個(gè)數(shù)在1～2之間，而O-糖基化個(gè)數(shù)在29～50之間(表4)。通過對(duì)GLUT4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)17種鳥類蛋白質(zhì)分子均不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖1)。

表2 17種鳥類SLC2A4基因堿基含量分析Table 2 Nucleotide composition (%) of SLC2A4 among 17 birds

藍(lán)色為α螺旋結(jié)構(gòu)，紅色為β片層結(jié)構(gòu)，紫色為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(以Anasplatyrhynchos為例)

圖1 GLUT4二級(jí)結(jié)構(gòu)
Figure 1 Secondary structure of GLUT4

2.3 進(jìn)化速率和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對(duì)編碼GLUT4的SLC2A4基因的進(jìn)化壓力分析發(fā)現(xiàn)，14種突胸總目(Carinatae)鳥類ω值1.195，具有明顯的正選擇效應(yīng)；而3種平胸總目(Ratitae)鳥類ω值0.433，有純化選擇作用；17種鳥類的ω值為0.685；使用PAML程序包對(duì)選擇壓力進(jìn)行分析，均未檢測到正選擇位點(diǎn)。使用Datamonkey的SLAC算法，17種鳥類GLUT4找到4個(gè)正選擇位點(diǎn)，46個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)(P=0.01)。

研究中系統(tǒng)發(fā)育樹圖的枝長和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)源于貝葉斯推斷法樹圖，通過構(gòu)建GLUT4系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩枝：Ratitae分為第一枝，包括Struthioniformes、Apterygiformes和Tinamiformes 3個(gè)目； Carinatae構(gòu)成第二枝，即Galliformes、Anseriformes、Columbiformes和Passeriformes(圖2)。

表3 GLUT4的氨基酸理化性質(zhì)分析Table 3 Physicochemical property of GLUT4

表4 GLUT4的糖基化分析Table 4 Glycosylation analysis of GLUT4

3 討論

SLC2A4基因及其編碼蛋白GLUT4是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，是維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，該蛋白質(zhì)是細(xì)胞在胰島素刺激的情況下發(fā)生的急性反應(yīng)，主要表達(dá)在脂肪、心肌和骨骼肌等對(duì)胰島素相對(duì)敏感的組織中，與骨骼肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生具有重要作用[3,22]。研究表明，敲除小鼠的SLC2A4基因會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良等癥狀，表明該基因在動(dòng)物血糖穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮極其重要的作用[11-12,21]。通過對(duì)SLC2A4基因的長度、堿基變異分析，發(fā)現(xiàn)在鳥類中該基因具有較高的變異率。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在平胸總目和突胸總目鳥類中發(fā)生了明顯的適應(yīng)性進(jìn)化，平胸總目鳥類中該基因選擇壓力ω<1，表明該基因選擇壓力為純化選擇作用，可能是由于與該總目的鳥類不善于飛翔，骨骼肌耗能較小，因此只需要較少的葡萄糖相關(guān)。在對(duì)突胸總目鳥類中，該基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了顯著的選擇壓力的變化，即ω>1，表明該基因經(jīng)歷明顯的正選擇作用，這可能與該總目鳥類普遍善于飛翔，需要大量的能量，因此骨骼肌細(xì)胞需要吸收大量的葡萄糖來維持能量的需求。研究結(jié)果表明，在不同的物種中GLUT4均具有明顯的糖基化修飾，通過改變其空間結(jié)構(gòu)增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[23-24]，本研究對(duì)鳥類的GLUT4研究發(fā)現(xiàn)，尤其是在突胸總目鳥類中均具有大量的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)為能夠加速葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，推測可能與鳥類飛翔時(shí)需要大量的能量有關(guān)。通過對(duì)GLUT4蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)17種鳥類蛋白質(zhì)分子均不存在跨膜結(jié)構(gòu)，與小鼠蛋白存在明顯區(qū)別[25-26]。

圖2 基于GLUT4序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

ML和BI系統(tǒng)發(fā)生樹分為Ratitae和 Carinatae兩枝，且獲得了較高的支持率，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相吻合，表明該系統(tǒng)樹均能夠很好地反映物種進(jìn)化的歷史[27-28]，這說明SLC2A4 基因編碼的GLUT4蛋白具有較強(qiáng)的系統(tǒng)發(fā)育意義，可以作為研究鳥類進(jìn)化的理想分子標(biāo)記。