章嘯君，屠平光，項 云

(金華農業(yè)科學研究院，浙江 金華 321007)

1 引言

精液冷凍保存就是利用干冰(-79 ℃)、液氮(-196 ℃)或其它制冷設備作為冷源，將精液經過特殊處理后，保存在極低溫度下，完全抑制了精子的代謝活動，使精子的生命在休眠狀態(tài)下保存下來，升溫后復蘇而不失去受精能力，使精液達到長期保存的方法。這項技術極大限度的提高了優(yōu)良種公畜的利用率，減少公畜的飼養(yǎng)量以及疾病的傳播，有利于家畜品種的雜交改良，加快遺傳進展。1956年，英國人ploge開始研究豬精液冷凍保存技術。在1950～1960期間的研究中，利用牛精液冷凍方法冷凍豬精液，解凍后的精子具有活力，但是沒有受精能力[1]。 1970年，Ploge[2]首次報道，用腹腔手術授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管，獲得83%的受精卵，并得到凍精生產的小豬。目前，豬精液冷凍保存技術與其他動物相比，雖然取得了一些進展，但仍然存在著冷凍技術程序復雜、冷凍后效果不穩(wěn)定等問題。本試驗通過對金華豬精液冷凍過程中，不同稀釋液、冷凍及解凍方法等各個方面進行研究，從精子活力、畸形率和質膜完整率等方面來綜合評價冷凍精液的結果，旨在探索優(yōu)化出金華豬精液較好的冷凍和解凍方法，為建立實用化的金華豬精液冷凍保存程序提供參考，為今后在金華豬種質資源的保存和利用提供可靠的技術方法。

2 材料與方法

2.1豬精液來源 豬精液采自金華市農業(yè)科學研究院金華豬選育場金華豬種公豬。

2.2 主要試劑與儀器葡萄糖、檸檬酸鈉、半胱氨酸、Tris等所用試劑均購自Sigma公司,紅寶石精子記數板WT-2000C、精子程序冷凍儀與精液質量分析系統(tǒng)均購自北京田園奧瑞公司。

2.3 稀釋液配方 3種稀釋液分別用10%的檸檬酸鈉調節(jié)pH值至6.8,抗生素均為青霉素含量為1000 IU/mL、鏈霉索1000 μg/mL。臨用前取冷凍稀釋液和新鮮蛋黃二者比例為80%∶20%混合攪拌均勻，冷卻至17 ℃?zhèn)溆谩?種稀釋液組分，見表1。

表1 3種稀釋液組分

2.4精液采集 手握法采集金華豬公豬精液中段，經2層精液過濾紙除去雜質，用BTS稀釋液在等溫條件下按1∶1體積比稀釋，2 h內運回實驗室，用精液分析儀檢測精子的精子活率和畸形率。最后取精子活力在70%以上，畸形率15%以下的精液用于冷凍保存試驗。

2.5精液的稀釋與平衡 采用二步稀釋法，對原精先用不含甘油的稀釋液稀釋，待溫度慢慢降至5 ℃后，平衡1.5 h,再加入含甘油的稀釋液，甘油的工作濃度為3%,混勻后立即在低溫操作柜中進行0.5 mL細管灌裝。

2.6精液的冷凍 方法一:采用程序冷凍儀冷凍，將封好的細管置于程序冷凍儀內(5 ℃)，以5 ℃/min的降溫速率，從5 ℃降溫至-10 ℃，然后以60 ℃/min的降溫速率，從-10 ℃降溫至-130 ℃，最后投入液氮保存。方法二：采用液氮熏蒸冷凍法，將細管冷凍架置于裝有液氮的冷凍箱內，使細管距液氮面4 cm處，熏蒸10 min后直接投入液氮保存。

2.7精液解凍 從液氮中取出精液細管，在水浴中解凍，輕輕搖動至融化，解凍條件為37 ℃，30 s、45 ℃，20 s、60 ℃，8 s水浴，用剪刀剪開細管兩端將精液倒入10 mL裝有解凍液試管中混勻。

2.8精液解凍后洗滌 將解凍后的精液放入離心管中，加入3倍量的洗精液，以800轉/分鐘的速度離心10 min，除去上清液；同樣的洗滌重復3次。將洗滌好的精液用洗精液稀釋至精子密度在106個/mL左右，在37 ℃平衡30 min后進行精液品質的檢查。

2.9精液品質的檢查

2.9.1精子活力、畸形率的檢查 分別對各試驗組冷凍后的精液進行抽樣檢查，取10 μL精液放在紅寶石精子記數板中(37 ℃)，使用精液質量分析系統(tǒng)分析精子活力、畸形率。

2.9.2精子質膜完整性的檢測 本試驗采用低滲腫脹法[2],用低滲腫脹實驗(HOST)測定精子樣本的彎尾率即為質膜完整率。將精子樣本稀釋到1×106個/mL，取500 μL加入1 mL低滲液中,置于37 ℃水浴處理60 min；取5 μL精液滴于載玻片上，加蓋玻片后在相差顯微鏡下計數，至少計數100個精子。

2.10數據處理 應用Graphpad Prism 5軟件對數據進行顯著性檢驗，相關數據采用F檢驗進行統(tǒng)計學處理，P<0.05為存在顯著性差異。

3 結果與分析

3.1不同冷凍稀釋液效果比較 從試驗數據上我們可以看出，Ⅱ、Ⅲ號冷凍稀釋液處理組解凍后精子的活力、畸形率和質膜完整性都明顯地高于Ⅰ號冷凍稀釋液(P<0.05)；Ⅱ號冷凍稀釋液和Ⅲ號冷凍稀釋液處理組之間沒有明顯差異(P>0.05)。具體數據見表2。

表2 不同冷凍稀釋液效果比較

注：同列標注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

3.2不同解凍方法對精子品質的影響 由表3可知，采用60 ℃，8 s方法解凍，精子活力顯著高于其他2組(P<0.05)，畸形率顯著低于37 ℃，30 s組(P<0.05)，但與45 ℃，20 s組相比差異不顯著(P>0.05)。頂體完整率雖高于其他2組，但差異不顯著(P>0.05)。具體數據見表3。

表3 不同解凍方法對精子品質的影響

注：同列標注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

3.3不同冷凍方法對精子品質的影響 由表4可知，采用程序冷凍儀冷凍法，解凍后精子活力顯著優(yōu)于液氮熏蒸冷凍法組 (P<0．05),畸形率、質膜完整率與液氮熏蒸冷凍法組相比差異不顯著(P>0.05)。具體數據見表4。

表4 不同冷凍方法對精子品質的影響

注：同列標注字母不同的表示差異顯著(P<0．05)；同列標注字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)

4 討論

冷凍稀釋液是精子的保護劑，可以減弱精子運動、抑制精子代謝、延長精子體外存活時間，對精液冷凍的效果有重要的影響。本試驗比較了幾種豬精液冷凍稀釋液的冷凍效果，結果發(fā)現Ⅱ、Ⅲ號冷凍稀釋液處理組解凍后精子的活力、 畸形率和質膜完整率都明顯地高于Ⅰ號冷凍稀釋液(P<0.05)；Ⅱ號冷凍稀釋液和Ⅲ號冷凍稀釋液處理組之間沒有明顯差異(P>0.05)。在Ⅱ、Ⅲ號冷凍稀釋液中含有半胱氨酸、BsA和Tris,研究發(fā)現半胱氨酸替代部分糖類物質有利于提高精液冷凍的效率。氨基酸在精液冷凍-解凍過程中對精子的保護作用早以引起重視，人們已經發(fā)現在羊精子的保護液中加入氨基酸能使精子內部結合比較松的絡合物的損失大大降低，其效果比糖類要好[3]。同時，糖類也是保護劑的重要組成部分，它是一種重要的低溫保護劑，同時也能夠為精子提供能量，低濃度的葡萄糖和乳糖混合使用其冷凍效果將大大提高[4]，與本試驗結果基本一致。BSA作為一種大分子蛋白物質，除了可以給精子提供能量外，還可以增加稀釋液的粘稠度，使降溫過程有所緩和，這符合精液稀釋后冷平衡的要求；Tris作為一種良好的緩沖物質，可以使稀釋液有一個穩(wěn)定的pH值，這可能是在精液稀釋后冷平衡過程中保持精子活力和質膜完整的一個重要因素[2]。

冷凍到-196 ℃仍存活的精子只有用適宜的解凍方法，才能確保其復活。因為解凍過程中精子要兩次經過臨界溫度區(qū)(-60 ℃ 和-15 ℃)。適當的解凍溫度能使冷凍的精子快速越過危險溫區(qū)，使玻璃化快速越過結晶態(tài)而直接變?yōu)橐簯B(tài)，降低對精子的傷害[4]。目前，在大多數豬精液冷凍研究中普遍采用 37 ℃，30 s條件對冷凍精液解凍。本實驗對比了 37 ℃，30 s、45 ℃，20 s和60 ℃，8 s,3種溫度下的解凍效果，發(fā)現60 ℃，8 s解凍更適合于0.5 mL細管的金華豬凍精解凍。采用該優(yōu)化方案除可獲得較高的精子解凍后活力外，質膜完整率 (50.3±3.3)%也較高；精子凍后的畸形率(17.7±1.8)%最低。在一定范圍內，隨著解凍溫度上升，精子的活率和頂體完整率也隨之上升。而杜立銀[5]等在研究中也發(fā)現，高溫快速解凍豬冷凍精液的效果好于低溫慢速解凍。在豬精液冷凍液中含有大量卵黃、甘油等物質，混合物粘性較大，在低溫下融解速度慢，容易形成冰晶傷害精子，而在相對高的溫度下，快速解凍可以減少這種傷害[6]。本實驗中的解凍液為BTS，pH值為弱堿性，弱堿性能夠激活精子的運動性，提高精子活力。但是用堿性稀釋液解凍后精子存活時間可能要短一些，因此解凍后要及時輸精或者開展別的實驗。

本試驗同時也對比了不同冷凍方法對精子品質的影響，試驗結果表明：采用程序冷凍儀冷凍法，解凍后精子活力顯著優(yōu)于液氮熏蒸冷凍法組 (P<0.05),畸形率、質膜完整率與液氮熏蒸冷凍法組相比差異不顯著(P>0.05)?？赡苤饕怯捎谝旱衾鋬龇ň嚯x液氮面距離較近時，使精液溫度下降迅速，超過精液承受能力，使解凍后精子活力下降，而如果距離較遠，則會使遠端精液不能快速冷凍，同樣也影響解凍后精子活力下降。

因此采用程序冷凍儀冷凍法，使用Ⅲ號冷凍稀釋液，在60 ℃，8 s水浴解凍方法更為適合0.5 mL細管金華豬凍精冷凍保存及解凍。通過本試驗能夠為金華豬精液的冷凍技術提供理論支持，為今后在金華豬的種質資源保存利用提供可靠的技術方法。