李繼紅 阿爾祖古麗·米爾阿卜杜拉 金曉倩 黃鶯（通訊作者） 馬依彤 馬翔 劉芬 陳邦黨 劉成

（1 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院冠心病二科 新疆 烏魯木齊 830054）

（2 新疆心血管病研究所 新疆 烏魯木齊 830054）

心肌梗死是心力衰竭是主要原因之一。研究其發(fā)病機(jī)制，有助于尋找新的干預(yù)措施，來(lái)提高預(yù)防及治療效率，達(dá)到提高患者的生存率及生活質(zhì)量、改善冠心病心肌梗塞預(yù)后的目的。與衰老有關(guān)的氧化應(yīng)激是缺血性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制之一，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的機(jī)體活性氧簇（ROS）促使動(dòng)脈硬化斑塊破裂,導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血栓形成；急性心肌梗塞發(fā)生時(shí)，ROS 會(huì)參與到組織損傷反應(yīng)[1-2]。研究顯示，ROS 的不良作用可能被抗氧化應(yīng)激反應(yīng)所抑制，起到改善缺血性心力衰竭預(yù)后的作用。叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞族(forkhead box transcription factor O,FoxO)是重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，過(guò)表達(dá)FOXO1 可以抑制ROS 并減少心肌細(xì)胞死亡[3],但轉(zhuǎn)基因的方法會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，因此需要尋找合適的載體進(jìn)行靶向基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)ox O1、Fox O3a 及 Fox O4 對(duì)維持心功能和調(diào)節(jié)心臟應(yīng)力有至關(guān)重要的作用[4]。其中，F(xiàn)oxO3a 能夠抑制腫瘤進(jìn)展，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及血管平滑肌的生物學(xué)功能，同時(shí)有明確的抗氧化應(yīng)激作用，因此，可能可用于心血管疾病的診治。因此本研究擬通過(guò)觀察重組腺病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)Fox O1、Fox O3a基因?qū)θ毖?復(fù)氧(H/R)心肌細(xì)胞的作用，探討其抗氧化作用及由此帶來(lái)的細(xì)胞功能變化，報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

將H9C2 小鼠的心肌細(xì)胞先缺氧(H)3h 后，復(fù)氧(R)6h，然后建立缺氧/復(fù)氧損傷模型；然后隨機(jī)分為5 個(gè)組：A 組為Control 組，B 組為缺氧/復(fù)氧（H/R）組），C 組為缺氧/復(fù)氧+FOXO1 組，D 組為缺氧/復(fù)氧+FOXO3a 組、E 組為缺氧/復(fù)氧+FOXO1+FOXO3a 組。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞裂解后進(jìn)行蛋白定量，20μg/孔，加上樣緩沖液沸水浴后離心取上清上樣，PAGE膠放入電泳槽并加緩沖液，加樣，80V 20min；電泳后膠移入轉(zhuǎn)膜緩沖液，剪下PVDF 膜，甲醇浸泡3min，水洗2min，剪6 塊濾紙與PVDF 膜，然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。轉(zhuǎn)膜裝置設(shè)定為恒流200mA，40min。膜洗1 次（放入TBST 中），然后置于麗春紅染色液中,5min 后水洗膜至水變清無(wú)色蛋白條帶清晰。5% BSA 室溫封閉1 h，一抗和膜4 ℃中孵育過(guò)夜。孵育一抗的膜洗滌（實(shí)驗(yàn)室TBST）3 次后按1 ∶5000 稀釋二抗，與膜37℃孵育1 h。洗滌3 次，于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行拍照。

1.2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)活性氧的水平 稀釋好的蛋白0.1ml 加入，4℃放置一夜。次晨，清洗。在已包被好的反應(yīng)孔加 0.1ml稀釋好的標(biāo)本，37℃培育1h。將稀釋好的酶標(biāo)抗體 0.1ml加入到實(shí)驗(yàn)孔，37℃培育0.5 ～1h。把TMB 溶液滴人各反應(yīng)孔中，培養(yǎng)（在37℃，10 ～30 min）后使用 H2SO4（ 0.05ml）終止實(shí)驗(yàn)。對(duì)其吸光度OD 值進(jìn)行測(cè)量：調(diào)整ELISA 檢測(cè)儀波長(zhǎng)為450nm，或用波長(zhǎng)為410nm 的ABTS 顯色。見(jiàn)圖1。

圖1 組織細(xì)胞中T-AOC 能力

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 爬片細(xì)胞固定（4%多聚甲醛）20 ～30min，進(jìn)行室溫（用百分之一TritonX-100）通透3 ～5min；滴加100μl DNase I 反應(yīng)液，37℃30min，并且配制TdT 酶反應(yīng)液： 37 度避光反應(yīng)60 min，每個(gè)樣本中滴加50μl Streotavidin-Fluorescein 標(biāo)記液后放入濕盒，37 度避光反應(yīng)30min，Hoechst 復(fù)染細(xì)胞核：用pH7.4 的PBS 洗滌3 次，去除PBS 后，加入Hoechst 染液。孵育10min（避光室溫）。鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Brdu 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 H9C2 細(xì)胞以5×104cells/ml細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，1ml/孔，溫度為37 ℃，培養(yǎng)（在5% CO2培養(yǎng)箱中）24h。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行不同處理，在48h 后終止細(xì)胞培養(yǎng)之前，加入BRDU(50μM)，37℃孵育40min。吸棄培養(yǎng)液，靜置5min 后吸出液體，重復(fù)5 次。甲醇/醋酸固定10min。經(jīng)固定的玻片空氣干燥，用0.3% H2O2-甲醇30min 滅活內(nèi)源性氧化酶。用封閉（5%的BSA）。變性核酸5min（100℃的甲酰胺）。冷卻。使用PBS 洗滌，加入抗大鼠BrdU 單抗，4℃過(guò)夜孵育。加PBS 洗滌，并重復(fù)5 次。加熒光二抗，在37℃中孵育1h。加PBS洗滌，再重復(fù)5 次。使用Hoechst 33258 染液孵育30min（室溫避光）后，鏡下觀察拍照保存。

2.結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后H9C2 細(xì)胞蛋白表達(dá)

WB 結(jié)果顯示：FOXO1 在B 組表達(dá)最低，F(xiàn)OXO1 病毒作用后表達(dá)會(huì)明顯的上升，且高于A 組；FOXO3a 病毒基本不會(huì)影響FOXO1表達(dá)；FOXO3a 蛋白在B 組中表達(dá)也是會(huì)最低，F(xiàn)OXO3a 病毒作用后其表達(dá)則會(huì)明顯的上升，且高于A 組，F(xiàn)OXO1 病毒對(duì)FOXO1 蛋白的表達(dá)有一定影響。見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中FOXO1 與FOXO3a 的表達(dá)

2.2 FOXO1 與FOXO3a 對(duì)H9C2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：SOD與T-AOC活性的表達(dá)趨勢(shì)基本相同，均為B 組中表達(dá)最低。FOXO1 與FOXO3a 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)升高明顯；MDA 含量、ROS 活性及NO 含量檢測(cè)趨勢(shì)基本相同，均為B 組中表達(dá)最高，F(xiàn)OXO1 或/與FOXO3a 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)降低明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的水平

2.3 FOXO1 與FOXO3a 的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)缺氧/復(fù)氧H9C2 細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 結(jié)果提示：藍(lán)光代表正常細(xì)胞核，綠光代表凋亡的細(xì)胞核；A 組的凋亡是最少的，B 組的凋亡情況最多，C 和D 組的凋亡率顯著低于B組，而E組的凋亡進(jìn)一步下降，但仍高于A組。見(jiàn)圖4。

圖4 TUNEL 檢測(cè)H9C2 細(xì)胞的凋亡情況

2.4 FOXO1 與FOXO3a 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于缺氧/復(fù)氧H9C2 細(xì)胞增殖活力的影響

Brdu 檢測(cè)結(jié)果提示：藍(lán)光代表正常的細(xì)胞核，紅光代表增殖的細(xì)胞核，A 組的增殖能力顯著高于其他四組；B 組的增殖能力最低；C、D 組的增殖能力要顯著高于B 組，但比A 組低；E 組的增殖能力高于C 組及D 組，比A 組略低。見(jiàn)圖5。

圖5 Brdu 法檢測(cè)缺氧/復(fù)氧H9C2 細(xì)胞的增殖活力

3.討論

目前，缺血性心肌損害已成為心力衰竭的首要病因，而氧化應(yīng)激反應(yīng)在心力衰竭的發(fā)生及進(jìn)展中起到了至關(guān)重要的作用。FoxO 是重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子。既往研究顯示：在肝細(xì)胞中，通過(guò)上調(diào)FOXO1 的蛋白的表達(dá)，可抑制裸鼠皮下移植性肝腫瘤的生長(zhǎng)[3]；成骨細(xì)胞中增強(qiáng)FOXO1 的活性可降低Bcl-2 表達(dá)，使成骨細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。有研究表明，F(xiàn)OXO1 還可激活FasL、CD95、Bim 促凋亡蛋白的表達(dá)[5-6]，提示了FOXO1 重新激活可能是細(xì)胞存活與凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。而通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO3 的表達(dá)，能夠阻礙缺血性損傷和心肌梗死患者病情的進(jìn)展。FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)可抑制 VSMCs 增殖并有抗氧化應(yīng)激作用，繼而可能會(huì)降低高血壓對(duì)機(jī)體的影響[7]。心血管疾病中Fox O3a 有保護(hù)和損傷的雙重作用，如何更好地利用其調(diào)控機(jī)制治療心血管疾病值得進(jìn)一步研究。

本研究顯示，F(xiàn)oxO1、FoxO3a 被重組腺病介導(dǎo)后轉(zhuǎn)染缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞，有效的減少了細(xì)胞的凋亡。據(jù)此得出結(jié)論，F(xiàn)OXO1 與FOXO3a 的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕了氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)H9C2 心肌細(xì)胞的損傷。H9C2 心肌細(xì)胞的增殖、存活能力明顯的改善。此研究結(jié)果，為缺血性心臟病心力衰竭的基因治療提供了新的研究數(shù)據(jù)，并開(kāi)拓了新的研究領(lǐng)域，為藥物研究提供了新的靶點(diǎn)。