陳嘯陽(yáng)，張毅峰

（蘇州市第九人民醫(yī)院，江蘇 蘇州）

0 引言

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是以肝內(nèi)脂肪變性為主要特征的一類(lèi)疾病，已成為世界上影響人類(lèi)健康最常見(jiàn)的肝臟疾病[1,2]。研究顯示，約有20-33%的西方人和15-30%的中國(guó)人受到NAFLD 的困擾[3]。如果不加以控制，肝單純的脂肪變性可進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH）、肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌[4,5]。除此之外，NAFLD 也是2 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病和慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn)因素[6,7]。NAFLD 發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前治療手段相對(duì)局限，主要包括生活習(xí)慣干預(yù)（節(jié)食和運(yùn)動(dòng)）、胰島素增敏劑（吡格列酮）和他汀類(lèi)降脂藥等[8]，但由于患者對(duì)生活干預(yù)的順應(yīng)性差及藥物的不良反應(yīng)，嚴(yán)重限制了NAFLD 的臨床治療效果[4]。因此，尋找有效治療NAFLD 的藥物迫在眉睫。

番茄紅素（Lycopene， Lyc）屬于類(lèi)胡蘿卜素家族，是一種無(wú)環(huán)、親脂性的類(lèi)胡蘿卜素，廣泛分布在紅顏色的蔬菜和水果中，如番茄、西瓜、胡蘿卜和紅葡萄柚[9,10]。研究顯示，番茄紅素具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝活動(dòng)，改善肥胖并發(fā)癥和修復(fù)肝功能[11]。大量動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可改善高脂飲食（high-fat diet， HFD）誘導(dǎo)的肝脂肪變性[9,12-14]。除此之外，Li 等[15]發(fā)現(xiàn)，番茄粉可通過(guò)激活Sirt1 抑制HFD 誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性。番茄紅素作為番茄粉的主要成分，其是否可通過(guò)激活Sirt1改善NAFLD，目前尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用PA 誘導(dǎo)的體外NAFLD 模型，旨在探討不同劑量番茄紅素的降脂活性及其潛在機(jī)制，為臨床使用番茄紅素治療NAFLD 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Oil Red O 粉末和棕櫚酸鈉粉末購(gòu)自Sigma 公司；番茄紅素購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；TG 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Sirt1 和PPARα 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自武漢proteintech 公司；ECL 購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞（HepG2）購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 和1%（青霉素/鏈霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2 的飽和濕度培養(yǎng)箱，每?jī)商鞊Q液一次，待細(xì)胞融合至60-80%時(shí)傳代。

1.3 MTT 實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 以1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80% 時(shí)，使用不同濃度的番茄紅素單獨(dú)處理或與PA 共同處理24h，正常組給予空白培養(yǎng)基，處理結(jié)束后，每孔加MTT 母液10μL，37oC 培養(yǎng)箱孵育4h，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm 處的吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，細(xì)胞相對(duì)存活率=（實(shí)驗(yàn)孔OD 值- 空白孔OD 值）/（對(duì)照孔OD 值- 空白孔OD 值）×100%。

1.4 WB 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞刮收集細(xì)胞，RIPA 強(qiáng)裂解液冰上裂解30min，12000rpm離心15min，吸取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將各組蛋白調(diào)至相同濃度后，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，每孔加入40-60μg 蛋白，用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1-2h 后，分別用一抗4℃孵育過(guò)夜，HRP 標(biāo)記二抗室溫孵育1-2h，采用ECL 顯色液顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用mean ± SEM 表示，多組間比較采用單因素方差分析 (one-wayANOVA)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對(duì)模型狀態(tài)下HepG2 細(xì)胞活力的保護(hù)作用

圖1 番茄紅素對(duì)模型狀態(tài)下HepG2 細(xì)胞活力的保護(hù)作用

MTT 結(jié)果顯示（圖1B），番茄紅素在80 μM 以下對(duì)HepG2 細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（P＞0.05）；與正常組相比，PA（0.5 mM）可顯著抑制HepG2 細(xì)胞活力，而番茄紅素可劑量依賴(lài)性的增加HepG2的細(xì)胞活力（圖1D）（P＜0.05）。這提示對(duì)番茄紅素可改善PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞損傷。

2.2 番茄紅素對(duì)PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的改善作用

肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是NAFLD 的主要特征之一并可進(jìn)一步引起肝細(xì)胞損傷，為了進(jìn)一步探討番茄紅素對(duì)模型下HepG2 的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)使用Oil Red O 和TG 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化。結(jié)果顯示，番茄紅素可劑量依賴(lài)性的降低HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。這提示，番茄紅素對(duì)HepG2 的保護(hù)作用可能與緩解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積有關(guān)。

2.3 番茄紅素對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 表達(dá)的影響

Sirt1 和PPARα 是參與肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵蛋白，為了闡明番茄紅素的降脂機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用Westernblot 檢測(cè)細(xì)胞Sirt1和PPARα 的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，PA 組細(xì)胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 的表達(dá)明顯下調(diào)，番茄紅素可劑量依賴(lài)性的上調(diào)PPARα 的表達(dá)，而對(duì)Sirt1 的表達(dá)無(wú)影響。這提示，番茄紅素可能通過(guò)上調(diào)PPARα 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，緩解PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

3 討論

NAFLD 已成為困擾人類(lèi)健康的全球性問(wèn)題，尋找有效治療NAFLD 的藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。而天然產(chǎn)物具有安全性高、自然界含量豐富、藥效顯著等特點(diǎn)，一直以來(lái)是尋找有效藥物的天然寶庫(kù)。番茄紅素作為一種自然界常見(jiàn)的天然產(chǎn)物，具有體內(nèi)外強(qiáng)大的抗氧化作用，其抗氧化作用是維生素E 的100 倍，是谷胱甘肽的125 倍，對(duì)各種肝損傷具有保護(hù)作用[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以顯著改善PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，提高細(xì)胞活力。這種效應(yīng)與上調(diào)細(xì)胞內(nèi)PPARα 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。

Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的去乙酰化酶，在脂質(zhì)代謝和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)整中起著重要作用[18]。研究顯示，番茄粉可通過(guò)激活Sirt1 改善HFD 誘導(dǎo)小鼠肝脂肪變性[15]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，番茄紅素對(duì)Sirt1 的表達(dá)無(wú)明顯影響。這提示，番茄粉中的其他成分而非番茄紅素可上調(diào)Sirt1 的表達(dá)。為了進(jìn)一步明確番茄紅素的降脂機(jī)制，我們考察了番茄紅素對(duì)PPARα 的影響。PPARα 是參與脂肪酸氧化的關(guān)鍵靶蛋白[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，番茄紅素可劑量依賴(lài)性的上調(diào)PPARα 的表達(dá)。綜上，番茄紅素可通過(guò)上調(diào)PPARα 的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)氧化代謝，改善肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，增加細(xì)胞活力，進(jìn)而治療NAFLD。

圖2 番茄紅素對(duì)PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的改善作用

圖3 番茄紅素對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 表達(dá)的影響