董蒙蒙，袁 博，徐玲霞，曹小迎，蔣繼宏

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116)

紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬植物的總稱(chēng)，主要分布在北半球，是我國(guó)國(guó)家一級(jí)珍稀保護(hù)樹(shù)種，是世界公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物[1—2]，其有效抗癌成分是紫杉醇。紫杉醇最早由美國(guó)化學(xué)家Wani 等[3]在1963 年從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)中分離獲得，并確定為一種三環(huán)二萜生物堿類(lèi)化合物。紫杉醇可有效抑制癌細(xì)胞的增生繁殖且副作用小，在臨床上被廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分頭頸癌以及肺癌治療[4—6]。但是，在自然條件下紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，且紫杉醇主要存在于樹(shù)皮中，含量低，這是目前制約紫杉醇應(yīng)用的最大瓶頸。雖然目前已有報(bào)道通過(guò)人工全合成法可獲得紫杉醇單體，但成本較高，產(chǎn)率較低，合成工藝對(duì)環(huán)境也不友好，難以滿足目前對(duì)紫杉醇的需求[7—10]。提高天然狀態(tài)下紫杉醇的合成速率和含量成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

植物內(nèi)生菌是指一定階段或全階段生活在健康植物的組織和器官內(nèi)部而又不引起宿主植物明顯病害的真菌或細(xì)菌。在長(zhǎng)期進(jìn)化中，內(nèi)生菌與宿主協(xié)同進(jìn)化，并對(duì)宿主具有一定的促進(jìn)作用，甚至一些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生和宿主相同或相似的化合物。1993年Strobel等[11]首次從太平洋短葉紅豆杉樹(shù)皮中分離到一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，此后陸續(xù)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇及紫杉烷類(lèi)化合物的內(nèi)生真菌，因此人們對(duì)于紅豆杉內(nèi)生真菌的研究越來(lái)越多。相比較而言，對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌的研究較少[12—13]。有研究表明，植物內(nèi)生菌與其宿主生長(zhǎng)具有一定的關(guān)聯(lián)，因此從促生角度篩選、評(píng)價(jià)是紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌提高宿主代謝成分研究的重要切入點(diǎn)。

芽胞桿菌是廣泛存在于土壤與植物微生態(tài)中的微生物種群[14]，因其具有較強(qiáng)的抗逆能力及抗菌防病作用而被用于生物防治領(lǐng)域[15—16]。如蘇云金芽胞桿菌被廣泛用作微生物殺蟲(chóng)劑，枯草芽胞桿菌可產(chǎn)生脂肽類(lèi)抑菌物質(zhì)[17—18]。芽胞桿菌的生防作用機(jī)制主要有競(jìng)爭(zhēng)作用、誘導(dǎo)植物抗性作用、拮抗作用和促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用[19]。其中在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面尤以產(chǎn)IAA 較為普遍，IAA 是植物六大內(nèi)源激素之一，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中伴隨著病害的干擾，而某些芽胞桿菌也可以產(chǎn)生一些脂肽類(lèi)抑菌物質(zhì)，如表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐原素(Fengycin)，這些物質(zhì)可以有效保護(hù)植物免受病原菌入侵。本文以湖北星斗山自然保護(hù)區(qū)的南方紅豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)為樣品，對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定、產(chǎn)IAA 菌株篩選以及產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物研究，以期為森林資源保護(hù)及生物菌肥生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

內(nèi)生細(xì)菌分離樣品為采自湖北星斗山自然保護(hù)區(qū)健康成熟的南方紅豆杉新鮮植物組織，采摘后置于冰盒暫存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB：蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15～20 g，pH 7.0～7.2。

NA：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15～20 g，pH 7.0～7.2。

有氮培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，硫酸銨1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.1 g，酵母膏0.5 g，碳酸鈣0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌分離

參照文獻(xiàn)的方法對(duì)紅豆杉根莖葉植物組織消毒[20—21]，并在無(wú)菌條件下研磨。加一定量無(wú)菌水于分離培養(yǎng)基平板上稀釋涂布，然后置于30 ℃培養(yǎng)箱。待細(xì)菌長(zhǎng)出后，挑取單菌落四區(qū)劃線純化培養(yǎng)，甘油保存。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌鑒定

將分離純化的菌株搖床培養(yǎng)，使用CTAB 結(jié)合溶菌酶的方法提取細(xì)菌總DNA[22]，細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增使用通用引物27F(5′-CAGAGTTTGATCC TGGCT-3′)、1492R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGC A-3′)。PCR 反應(yīng)體系：27F(10 μmol·L-1)、1492R(10 μmol·L-1)及DNA 模板各1 μL，Mix(2×HiFi-PCR Master) 12.5 μL，加無(wú)菌雙蒸水至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并下載相似性較高的相關(guān)菌株16S rRNA 基因序列，分別用MUSUAL 及MEGA7.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，最后使用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并做系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 產(chǎn)IAA 菌株篩選

將分離的內(nèi)生菌株在液體LB 培養(yǎng)基中搖床過(guò)夜培養(yǎng)成種子液，將種子液按1%接種量接種于含色氨酸終濃度為0.5 mg·mL-1有氮液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r·min-1搖床暗培養(yǎng)5 d，每株菌3 次重復(fù)。參照文獻(xiàn)對(duì)培養(yǎng)的發(fā)酵液萃取[23—24]，低于40 ℃將萃取的乙酸乙酯相蒸干，加入2 mL 甲醇洗出蒸干物質(zhì)，過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜后使用。使用高效液相色譜-高分辨飛行質(zhì)譜測(cè)定IAA 含量，色譜條件如下：Halo C18色譜柱(4.6×150 mm，3 μm)；流動(dòng)相為水(0.1%甲酸，A)-甲醇(0.1% 甲酸，B)，比例為25:75；梯度洗脫，流速0.4 mL·min-1。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源正離子模式(ESI+)，離子源溫度550 ℃，電壓4500 V，碰撞電壓70 eV，去簇電壓30 eV，取130m/z為吲哚乙酸目標(biāo)定量離子，檢測(cè)限0.0015～0.5388 μg·L-1，在5～200 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好。

1.5 內(nèi)生菌產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物能力分析

按 1.4 方法獲得菌株發(fā)酵液提取物，利用HPLC-TOFMS 對(duì)提取物的脂肽類(lèi)化合物進(jìn)行分離、鑒定，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選菌株所產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物種類(lèi)及含量差異。色譜條件：Halo C18色譜柱(4.6×150 mm，3 μm)，流動(dòng)相水(0.1%甲酸，A)-乙腈(0.1%甲酸，B)，梯度洗脫，流速0.5 mL·min-1。梯度洗脫程序如下：0～20 min 內(nèi)，B 的比例從60%降至5.0%，并保持10 min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源正離子(EIS+)模式，離子源溫度400 ℃，碰撞電壓50 eV，去簇電壓10 eV，掃描范圍100～2000m/z。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Grapad prism 8.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以±SD表示誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離與鑒定

從南方紅豆杉根莖葉中共分離內(nèi)生細(xì)菌31 株，其中根18 株，莖8 株，葉5 株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA 序列得知，根中18 株內(nèi)生細(xì)菌均為厚壁菌門(mén)芽胞桿菌綱芽胞桿菌目菌株，其中1 株為Paenibacillaceae 科Brevibacillus菌株；1 株為動(dòng)球菌科Viridibacillus菌株；其余16 株均為芽胞桿菌科芽胞桿菌屬菌株，芽胞桿菌在根中屬于優(yōu)勢(shì)屬。莖中8 株菌主要分布在3 個(gè)門(mén)：厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)；4 個(gè)綱：芽胞桿菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱；4 個(gè)目：芽胞桿菌目、微球菌目、紅桿菌目、Lysobacaterales 目；4 個(gè)科：芽胞桿菌科、微桿菌科、紅桿菌科、Lysobacteraceae 科；4 個(gè)屬：芽胞桿菌屬、微桿菌屬、副球菌屬、Xanthomonas屬。葉中5 株菌主要分布在厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，2個(gè)綱：芽胞桿菌綱、α-變形菌綱；2 個(gè)目：芽胞桿菌目、鞘脂單胞菌目；2 個(gè)科：芽胞桿菌目、鞘脂單胞菌科；2 個(gè)屬：芽胞桿菌屬、鞘脂單胞菌屬(圖1)。

2.2 產(chǎn)IAA 菌株篩選

采用HPLC 法檢測(cè)樣品IAA 含量。結(jié)果表明，31 株內(nèi)生細(xì)菌中有20 株菌株具有產(chǎn)IAA 能力，其中根14 株，莖4 株，葉2 株。根葉中產(chǎn)IAA 菌株均為芽胞桿菌屬，而莖中4 株產(chǎn)IAA 菌株分別為微桿菌屬、芽胞桿菌屬、副球菌屬、Xanthomonas屬。同時(shí)從根中篩選出一株高產(chǎn)IAA 菌株，編號(hào)為KLBMPTC10，是芽胞桿菌屬菌株，產(chǎn)IAA 含量達(dá)210.3955±0.81 μg·L-1，芽胞桿菌屬菌株KLBMPTC31最低，可產(chǎn)IAA 0.2869±0.02 μg·L-1(圖2)。

圖1 基于16S rRNA 基因序列的南方紅豆杉分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the bacteria from Taxus wallichiana var.mairei based on the 16S rRNA gene sequences

圖2 南方紅豆杉產(chǎn)IAA 菌株及其IAA 產(chǎn)量Fig.2 IAA producing strains and contents in Taxus wallichiana var.mairei

2.3 內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物

利用LC-TOF-MS 對(duì)細(xì)菌提取物進(jìn)行分離，通過(guò)自建的細(xì)菌代謝產(chǎn)物庫(kù)，對(duì)產(chǎn)脂肽能力進(jìn)行篩選，目標(biāo)脂肽見(jiàn)表1，以分子離子峰強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)含量計(jì)算，結(jié)果如圖3。

從紅豆杉分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌脂肽類(lèi)化合物約22 種(表1)，通過(guò)定量可以看出每株內(nèi)生細(xì)菌的脂肽類(lèi)化合物在種類(lèi)和含量上都有顯著差異。從圖3 可知，菌株KLBMPTC10 所產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物最豐富，且含量比其他菌株高。其次是菌株KLBMPTC19、KLBMPTC01、KLBMPTC02 和KLBMPTC29。

利用LC-MS/MS 技術(shù)對(duì)菌株KLBMPTC10、KLBMPTC01 和KLBMPTC29 中的兩種典型的芽胞桿菌脂肽類(lèi)化合物Surfactin 和Iturin A2進(jìn)行定量分析，并以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的一株專(zhuān)利菌株Bacillus amyloliquefaciensCGMCC5569 為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(圖4)。分離獲得的三株內(nèi)生細(xì)菌所產(chǎn)Surfactin和Iturin A2與對(duì)照差異顯著。其中菌株KLBMPTC29產(chǎn)Surfactin 能力優(yōu)于其他兩株菌，相對(duì)含量為(24.47±4.05)%，菌株KLBMPTC10 產(chǎn)Iturin A2能力優(yōu)于其他兩株菌，相對(duì)含量為(26.06±2.68)%。

表1 目標(biāo)脂肽化合物篩選信息Table 1 The mass information of targeted lipopeptides

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生細(xì)菌多為植物內(nèi)有益寄生菌，在長(zhǎng)期的植物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中與宿主建立了和諧互惠的關(guān)系[25]。植物內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，可使內(nèi)生細(xì)菌不受外界環(huán)境影響，同時(shí)內(nèi)生細(xì)菌可增強(qiáng)植物的環(huán)境適應(yīng)能力。內(nèi)生細(xì)菌具有重要的生態(tài)和管理作用，還能作為潛在的生防資源和外源基因載體[26—27]。

圖3 南方紅豆杉內(nèi)生菌產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of lipopeptide compounds produced by endophytic bacteria of Taxus wallichiana var.mairei

圖4 基于LC-MS/MS 計(jì)算的3 株內(nèi)生細(xì)菌兩種典型脂肽類(lèi)化合物含量Fig.4 Quantitative calculation of two typic lipopeptides in three endophytic bacteria strains based on LC-MS/MS

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌研究較多，但主要集中于內(nèi)生細(xì)菌多樣性以及拮抗實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)紅豆杉內(nèi)生放線菌資源有較為系統(tǒng)的研究[28]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)紅豆杉內(nèi)生真菌研究居多[29—31]，但對(duì)紅豆杉，尤其是南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌研究較少。芽胞桿菌是一類(lèi)常見(jiàn)的細(xì)菌，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥生產(chǎn)方面都具有廣泛的應(yīng)用[32—33]，尤其以促進(jìn)宿主生長(zhǎng)為特色，成為目前微生物菌劑的重要選擇菌株之一。芽胞桿菌還可以產(chǎn)生許多對(duì)真菌、細(xì)菌以及病毒具有顯著抑制效果的物質(zhì)，產(chǎn)生的伊枯草菌素(Iturin)和表面活性素(Surfactin)已在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用[34]。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌可產(chǎn)生多種植物促生物質(zhì)，如吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等[35]。產(chǎn)IAA 的內(nèi)生菌再回接到宿主植物時(shí)大都能促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)[36—37]。本研究分離獲得的芽胞桿菌是產(chǎn)IAA 能力較強(qiáng)的一類(lèi)菌。芽胞桿菌屬分泌的吲哚乙酸和赤霉素可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。本研究通過(guò)HPLC-TOF-MS精確定量了各個(gè)菌株產(chǎn)IAA 能力，結(jié)果表明菌株KLBMPTC10 產(chǎn) IAA 能力最強(qiáng)，含量可達(dá)210.3955±0.81 μg·L-1。同時(shí)利用HPLC-TOF-MS 對(duì)各個(gè)菌株脂肽類(lèi)化合物種類(lèi)和相對(duì)含量進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果表明，KLBMPTC10 菌株是南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌中產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物最豐富的，該菌產(chǎn)Iturin A2能力優(yōu)于其他菌株，含量達(dá)(26.06±2.68)%。而Iturin 類(lèi)化合物具有顯著抑制真菌生長(zhǎng)的活性。因此綜合以上結(jié)論推測(cè)，KLBMPTC10 菌株在促生和生防方面都具有重要的潛力，作為紅豆杉內(nèi)生菌，該菌一方面具有提高宿主紅豆杉生長(zhǎng)發(fā)育的潛能，另一方面對(duì)可能存在的病原真菌等病菌具有拮抗作用的潛力，因此可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究，為全面開(kāi)發(fā)紅豆杉資源提供思路和研究基礎(chǔ)。