徐素素，高 靜，陳軍文，劉祥宇，張敬麗*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，自古以來被列為藥材上品，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，在抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等方面作用顯著[1—4]，越來越多的石斛藥材被加工成保健品、中成藥制劑。石斛屬(Dendrobium)是蘭科(Orchidaceae)種類最多的屬之一，《中國植物志》中記載石斛屬有74 種和2 變種[5—6]。云南有石斛屬植物58 種和2 變種[7]，是中國石斛資源最豐富的省份，是中國石斛屬植物地理分布中心和起源中心，也是中藥石斛的主要來源地和產(chǎn)地[8—9]。云南省內(nèi)以“石斛”命名的藥材高達(dá)27 種[10]，多用于治療感冒咳嗽、黃疸型肝炎、胃炎、濕疹、跌打損傷等病癥[11]。

由于石斛市場需求量大，自身繁殖率低、生長慢，生境破壞等原因，野生石斛資源瀕臨絕滅，現(xiàn)已被列為瀕危中藥品種之一[12]。藥用石斛資源珍貴且加工后失去原有形態(tài)特征，導(dǎo)致石斛藥材摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，藥用石斛的臨床療效和安全應(yīng)用得不到保障，亟需為石斛屬植物的鑒別建立快速、準(zhǔn)確以及簡便的鑒定方法，以保障石斛臨床用藥的安全性和有效性。僅憑借傳統(tǒng)的鑒定方法難以準(zhǔn)確地將中藥材從其混偽品中區(qū)分[13—15]。DNA 條形碼(DNA barcoding)是利用標(biāo)準(zhǔn)的DNA 序列從基因?qū)用鎸ξ锓N進(jìn)行鑒別，不受時(shí)間、環(huán)境、物種等因素的影響，具有較強(qiáng)的通用性和較高的識別準(zhǔn)確率[16]；陳士林團(tuán)隊(duì)[17—19]歷時(shí)10 年完成11000 余種樣品的DNA 條形碼研究，首次建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA 條形碼鑒定體系，并提出以ITS2序列作為植物通用DNA 條形碼，極大提升了中藥材鑒定能力，并被納入《中國藥典》2015 年版四部[20]。目前，DNA 條形碼已成功應(yīng)用于多個(gè)科屬的藥用植物及藥材鑒定[21—22]；在形態(tài)學(xué)上難以辨別的五味子(Schisandra chinensis)、金錢草(Lysimachia christinae)等藥用植物鑒定中也有較好的應(yīng)用[23—24]。DNA 條形碼技術(shù)在石斛屬中的應(yīng)用也越來越廣泛[25]，相關(guān)研究利用DNA 條形碼技術(shù)已成功區(qū)分多個(gè)石斛屬物種[26—28]。

本研究應(yīng)用核基因片段ITS和ITS2序列以及葉綠體基因片段psbA-trnH和matK序列對云南省內(nèi)常見的12 種藥用石斛進(jìn)行鑒定研究，為藥用石斛的基源鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于DNA 條形碼分析的36 份實(shí)驗(yàn)材料來自云南野蘭堂生物科技有限公司蘭科植物種質(zhì)資源圃(表1)，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)孟珍貴副教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載116 條序列用于后續(xù)分析(表2)。

表1 石斛屬植物樣本采集信息Table 1 Sample information of Dendrobium species

1.2 試劑與儀器

CTAB、NaCl、EDTA、氯仿、異戊醇和乙醇等為分析純；Tris、NaOH、液氮、滅菌雙蒸水、瓊脂糖粉；RNA 酶、2×TaqPCR Master Mix、D10000Marker、D5000Marker、6×Loading buffer 等。

DYY-8C 型電泳儀(北京六一儀器廠)；臺式冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)；PCR 儀[MJ Research(Waltham,MA,USA) PTC200-well thermal cycler]；紫外分光光度計(jì)(UV-2550 型，SHIMADZU 公司)、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取

稱0.2 g 石斛新鮮葉片，放入研缽中并加入液氮冷凍，快速研磨成粉，參考李金璐等[29]改良的CTAB法提取總DNA。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增

通用引物和PCR 反應(yīng)參考陳士林等[17]的研究，通用引物在擎科生物科技有限公司昆明分部合成。ITS、ITS2、psbA-trnH及matK擴(kuò)增引物見表3。PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包括2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物由擎科生物科技有限公司雙向測序。

表2 從GenBank 中下載序列信息Table 2 The information of sequence downloaded from GenBank

表3 序列引物Table 3 The sequence primers

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過DNAMan 對雙向測序結(jié)果進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。基于隱馬爾科夫模型(HMMer)的注釋方法[30]，去除5.8S 和28S 區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列；psbA-trnH序列則根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對獲得間隔區(qū)。

使用MEGA 7.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件分析序列堿基組成、GC 含量、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)；基于K2P(Kimura 2-parameter)模型計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離及構(gòu)建NJ(Neighbor Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，用自舉檢驗(yàn)法(Bootstrap test)檢驗(yàn)系統(tǒng)各分支置信度，循環(huán)1000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增及測序成功率分析

對36 個(gè)藥用石斛樣品提取總DNA 后利用通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測序。測序結(jié)果表明，所有序列的峰圖清晰、基線平整(圖1)，四條序列的擴(kuò)增及測序成功率均為100%。

圖1 部分樣品測序峰圖Fig.1 The partial peak graph of some samples

2.2 4 條候選序列特征分析

用于序列分析的ITS序列有72 條，ITS2序列60 條，psbA-trnH序列58 條和matK序列70 條，其中包括從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的36 條ITS序列、24條ITS2序列、22 條psbA-trnH序列和34 條matK序列(表4)。比對后的序列長度matK>psbA-trnH>ITS>ITS2，均小于1000 bp，滿足理想的DNA 條形碼長度要求。GC 平均含量ITS>ITS2>psbA-trnH>matK，分別為53.1%、52.7%、34.6%、32.1%。保守位點(diǎn)數(shù)psbA-trnH>ITS>ITS2>matK，分別占各自總位點(diǎn)數(shù)的89.6%、52.1%、47.4%、45.5%，psbA-trnH序列最保守。matK序列變異度最大，變異位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的54.8%；psbA-trnH序列的變異位點(diǎn)最少，變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的10.0%(表4)。

表4 4 條序列在12 種藥用石斛中的序列特征Table 4 The sequence characteristics of four sequences in twelve medicinal Dendrobium species

2.3 DNA 條形碼Gap 分析

利用MEGA 7.0 軟件基于K2P 遺傳距離模型計(jì)算四條序列和樣品的平均種內(nèi)、種間遺傳距離，包括ITS序列72 條，ITS2序列60 條，psbA-trnH序列58 條，matK序列70 條。四條序列的平均遺傳距離matK>ITS2>ITS>psbA-trnH；matK序列為0.509，ITS2序列為0.176，ITS序列為0.157，psbA-trnH序列為0.016；種內(nèi)平均遺傳距離ITS2>ITS>psbA-trnH=matK；ITS2序列為0.007，ITS序列為0.005，psbA-trnH序列與matK序列都為0.002；種間平均遺傳距離matK>ITS2>ITS>psbA-trnH，matK序列為0.556，ITS2序列為0.194，ITS序列為0.171，psbA-trnH序列為0.018。統(tǒng)計(jì)分析樣品的平均種內(nèi)、種間遺傳距離，得出遺傳距離分布圖(圖2)，ITS序列與ITS2序列的平均種內(nèi)種間遺傳距離趨勢大致相同且重疊較少。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建12 種藥用石斛ITS、ITS2、psbA-trnH、matK序列的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3～圖6。

圖2 4 條序列的Barcoding Gap 圖Fig.2 The Barcoding Gap diagram of four sequences

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences

圖4 基于ITS2 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on ITS2 sequences

如圖3 所示，基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將12 種藥用石斛全部區(qū)分開，并且具有較高支持度，可靠性較高；ITS2序列將系統(tǒng)發(fā)育樹分為11枝，區(qū)分開10 種藥用石斛，未能區(qū)分開來自黑毛組的長距石斛(D.longicornu) 和矮石斛(D.bellatulum)(圖4)；基于psbA-trnH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹不僅區(qū)分出全部石斛，還將齒瓣石斛(D.devonianum)分成兩個(gè)平行枝且聚在一起(圖5)；基于matK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹僅區(qū)分6 種藥用石斛，且支持度較低(圖6)。

3 討論

3.1 DNA 條形碼序列的獲取

DNA 條形碼不受時(shí)間、環(huán)境、物種等因素的影響，具有較強(qiáng)的通用性和較高的識別準(zhǔn)確率[16]。DNA 的提取是運(yùn)用DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定的先決條件，PCR 擴(kuò)增及測序成功率是評價(jià)DNA條形碼技術(shù)實(shí)用性及通用性的指標(biāo)[31]。目前核糖體ITS、ITS2基因和葉綠體基因組psbA-trnH、matK和rbcL序列是石斛常用的分子標(biāo)記，這些片段對石斛種間有較高的識別率[32—34]。本研究參考李金璐等[29]的CTAB 法進(jìn)行總DNA 提取，4 條候選序列(ITS、ITS2、psbA-trnH和matK)的PCR 擴(kuò)增及測序成功率均為100%，說明ITS、ITS2、psbA-trnH和matK序列在石斛屬中容易獲得。

3.2 不同條形碼序列Barcoding Gap 評估

圖5 基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 NJ phylogenetic tree based on psbA-trnH sequences

Barcoding Gap 是指物種的 DNA 條形碼序列在物種間變異大于種內(nèi)變異，且存在一個(gè)明顯間隔區(qū)[29]。本研究基于4 條序列構(gòu)建的Barcoding Gap都沒有明顯的間隔區(qū)，但I(xiàn)TS序列與ITS2序列的種內(nèi)和種間存在重疊的部分較少，有偏向兩端的趨勢(圖2)。黃海等[12]發(fā)現(xiàn)石斛屬植物ITS序列具有明顯的Barcoding Gap，張愛麗等[35]對主要滇產(chǎn)石斛鑒別中也發(fā)現(xiàn)ITS序列具有明顯的Barcoding Gap，這與本研究結(jié)果基本一致。

3.3 云南常見藥用石斛DNA 條形碼的篩選

DNA 條形碼能對不同物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定，但到目前為止還沒有找到適合植物界通用的DNA 條形碼。陳士林等[17]通過大量研究，提出將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列，中國植物DNA 條形碼研究組也建議將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼[36]。Kress 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH序列具有易擴(kuò)增和通用性好的優(yōu)點(diǎn)，建議將ITS和psbA-trnH兩個(gè)片段作為植物通用條形碼。邵世光等[33]對15 種常見的楓斗類石斛的psbA-trnH序列成功測序，并將葉綠體基因psbA-trnH間區(qū)與核基因組的rDNAITS序列聯(lián)合使用，作為楓斗類石斛分子鑒別的DNA 條形碼候選序列。對4 個(gè)候選序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，psbA-trnH和ITS序列鑒定結(jié)果較好；ITS序列的支持度高于psbA-trnH序列，結(jié)果更具說服力，但psbA-trnH序列將齒瓣石斛分為兩平行枝，說明psbA-trnH序列在種內(nèi)的鑒定結(jié)果優(yōu)于ITS序列。ITS2序列未能區(qū)分長距石斛和矮石斛，matK序列雖然變異度高，但構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類散亂，僅區(qū)分6 種藥用石斛。

圖6 基于matK 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 NJ phylogenetic tree based on matK sequences

綜合來看，建議以ITS和psbA-trnH序列作為云南常見藥用石斛鑒定序列，這可以為云南常見藥用石斛的基源鑒定提供可靠技術(shù)保障。