李 煊，梁 詩，黃 雯，許傳俊，明艷林*

(1.廈門華僑亞熱帶植物引種園/ 廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361002；2.福建省亞熱帶植物研究所/ 福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361006)

唇形科有10 亞科220 余屬3500 余種，多為半灌木或灌木，一年生至多年生草本植物，主產(chǎn)于地中海及中亞地區(qū)，我國(guó)有99 屬800 余種[1—2]。唇形科植物富含多種芳香油成分，具有明顯的芳香氣味，揮發(fā)性油類是其中研究較為深入的化學(xué)組分。

薄荷(Mentha haplocalyx) 和羅勒(Ocimum basilicum)均為常見的唇形科藥食兩用植物，餐飲中可作為調(diào)味料、香料或涼拌菜、煲湯等[3—4]，兩者皆為解表類中藥[5—8]，但薄荷和羅勒常被混用。《中國(guó)藥典》(2020)記載，薄荷為唇形科植物的干燥地上部分，夏、秋二季薄荷莖葉茂盛或花開至三輪時(shí)，選晴天，分次采割，曬干或陰干其地上部分可入藥，味辛，性涼，歸肺、肝經(jīng)，主要用于疏散風(fēng)熱，清利頭目，利咽，透疹，疏肝行氣[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，薄荷主要含有揮發(fā)油、黃酮、氨基酸、萜類等物質(zhì)[10]，具有鎮(zhèn)痛消炎[11]、抗菌[12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]、降血糖[15]等作用。羅勒味辛、甘，性溫，歸肺、脾、胃、大腸經(jīng)，全草可入藥，具有疏風(fēng)解表、化濕和中、行氣活血、解毒消腫之功效。羅勒主要含有揮發(fā)油、黃酮及其苷類、香豆素、多糖等成分[16]，具有抗菌[17]、抗炎[1]、抗氧化[18]、驅(qū)蚊蟲[19]及降糖、降脂[20]等作用。目前關(guān)于薄荷、羅勒的研究并不完善，相關(guān)研究主要集中在揮發(fā)油活性方面，對(duì)其保肝活性鮮有報(bào)道。本文通過自由基清除實(shí)驗(yàn)及酒精性肝損傷細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)對(duì)薄荷、羅勒水和乙醇提取物的抗氧化活性及保肝效果進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑儀器

薄荷和羅勒采于廈門華僑亞熱帶植物引種園。HepG2 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器有Thermo MK3 型酶標(biāo)儀、Thermo 超低溫冰箱、EYELA N-1100S-W 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Christ Alpha 2-4 LD plus 冷凍干燥機(jī)、Thermo 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、PerkinElmer Lambda25 紫外分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

稱取薄荷和羅勒干粉，分別用水和95%乙醇按料液比1:20，45 ℃超聲提取，收集濾液減壓濃縮(45 ℃)至無醇味，得到薄荷、羅勒水提物和醇提物浸膏。將浸膏于-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍12 h 后，冷凍干燥，得到提取物干燥粉末，密封保存于-20 ℃。

1.2.2 DPPH 自由基清除測(cè)定

分別取2 mL 不同濃度薄荷水提物、醇提物(50、100、200、400、800 μg·mL-1)和羅勒水提物、醇提物(100、200、400、600、800 μg·mL-1)以及陽性對(duì)照Vc(5、10、15、20、25 μg·mL-1)待測(cè)液，加入2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH 自由基溶液，搖勻，避光30 min后于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai；將DPPH 自由基溶液用等體積無水乙醇代替，其他同前，測(cè)吸光度Aj；將樣品用等體積無水乙醇代替，其他同前，測(cè)吸光度 Ae。DPPH 自由基清除率 K=[1-(Ai-Aj)/Ae]×100%。

1.2.3 ABTS 自由基清除測(cè)定

取7.9 mg ABTS 溶于10 mL 蒸餾水，另取1.3 mg過硫酸鉀溶于10 mL 蒸餾水，混合兩種溶液即得ABTS 儲(chǔ)備液，室溫條件下避光儲(chǔ)存過夜，使用時(shí)稀釋4 倍。分別取不同濃度薄荷水提物(20、40、60、80、100 μg·mL-1)、薄荷醇提物(1、2、5、10、25 μg·mL-1)、羅勒水提物(20、40、60、80、100 μg·mL-1)、羅勒醇提物(10、20、30、40、50 μg·mL-1)以及陽性對(duì)照Vc(2.5、5、10、15、25 μg·mL-1)樣品液和ABTS 稀釋液等量混合，在734 nm 處測(cè)吸光度；將樣品液用等體積水代替，其他同前，測(cè)吸光度。ABTS 自由基清除率K′=[1-(Ai′-Ae′)/(Aj′-Ae′)]×100%，K′為清除率，Ai′為加試樣反應(yīng)后ABTS 溶液的吸光度，Aj′為不加試樣溶液的吸光度；Ae′為不加ABTS 溶液的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞存活率測(cè)定

于96 孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞每孔3000 個(gè)，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度薄荷水提物(終濃度0、20、40、80、160、320 μg·mL-1)、薄荷醇提物(終濃度 0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1)、羅勒水提物(終濃度0、62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1)、羅勒醇提物(終濃度0、8、16、32、64、128 μg·mL-1)藥液，37 ℃孵育24 h 后，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1MTT 培養(yǎng)液，孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩20 min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 吸光度值。

細(xì)胞活力(%)=(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)/(對(duì)照孔吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100%。

1.2.5 酒精刺激HepG2 細(xì)胞存活率測(cè)定

參考羅燕梅等[21]方法，于96 孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞每孔3000 個(gè)，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度薄荷、羅勒水提物和醇提物(0、5、10、20、50 μg·mL-1)預(yù)處理24 h，各組加入終濃度800 mmol·L-1乙醇誘導(dǎo)損傷，正常對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，其他同1.2.4 處理并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄荷、羅勒水提物和醇提物DPPH 自由基清除能力

比較薄荷、羅勒水提物和醇提物與Vc(陽性對(duì)照)的DPPH 自由基清除能力。結(jié)果表明，薄荷、羅勒提取物均具有一定的抗氧化活性，其中薄荷水提物和醇提物具有較好的DPPH 自由基清除效果，且作用效果相近，而羅勒水提物和醇提物對(duì)DPPH 自由基的清除效果較弱。DPPH 自由基清除能力大小依次為Vc>薄荷醇提物>薄荷水提物>羅勒醇提物>羅勒水提物(圖 1)，其半效應(yīng)濃度(EC50)分別為12.65 μg·mL-1、70.42 μg·mL-1、75.77 μg·mL-1、354.87 μg·mL-1、451.53 μg·mL-1(表1)。

圖1 薄荷和羅勒水、醇提取物的DPPH 自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of Mentha haplocalyx and Ocimum basilicum extracts with water and ethanol

2.2 薄荷、羅勒水提物和醇提物ABTS 自由基清除能力

評(píng)價(jià)薄荷、羅勒水提物、醇提物和Vc(陽性對(duì)照)清除ABTS 自由基的能力。與清除DPPH 自由基能力相似，薄荷提取物整體上具有更好的ABTS 自由基清除效果，但不同的是，薄荷醇提物顯示出優(yōu)于陽性對(duì)照Vc的自由基清除效果，而羅勒水取物和醇提物均呈現(xiàn)出較好的ABTS 自由基清除效果。ABTS 自由基清除能力大小依次為薄荷醇提物>Vc>羅勒醇提物>薄荷水提物>羅勒水提物(圖2)，其半效應(yīng)濃度(EC50)分別為9.04 μg·mL-1、9.31 μg·mL-1、18.03 μg·mL-1、22.18 μg·mL-1、36.88 μg·mL-1(表1)。

表1 薄荷、羅勒提取物自由基清除能力Table 1 Radical scavenging capacity of Mentha haplocalyx and Ocimum basilicum extracts

圖2 薄荷和羅勒水、醇提取物的ABTS 自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity of Mentha haplocalyx and Ocimum basilicum extracts with water and ethanol

2.3 薄荷、羅勒水提物和醇提物對(duì)酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的影響

采用HepG2 細(xì)胞模型評(píng)價(jià)薄荷、羅勒水提物和醇提物對(duì)酒精肝損傷的保護(hù)效果，首先對(duì)薄荷、羅勒水提物和醇提物的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，薄荷水提物、醇提物和羅勒水提物、醇提物分別在320 μg·mL-1、100 μg·mL-1、500 μg·mL-1、128 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)對(duì)模型細(xì)胞株HepG2 無細(xì)胞毒性(圖3)。

在對(duì)薄荷、羅勒水提物和醇提物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，選擇無毒濃度5、10、20、50 μg·mL-1進(jìn)行酒精肝損傷保護(hù)效果評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，薄荷水提物、薄荷醇提物和羅勒水取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)效果，而羅勒醇提物未見明顯效果(圖4)。薄荷水提物和醇提物處理組中，與對(duì)照相比，模型組(eth)細(xì)胞存活率分別下降至41.21%和41.80%，而使用薄荷水提物和醇提物處理的藥物濃度組細(xì)胞存活率顯著增加，在濃度50 μg·mL-1處理下，薄荷水提物和醇提物使細(xì)胞存活率分別比模型組提高了33.97%、44.72%；羅勒水提物處理組中，模型組細(xì)胞存活率相對(duì)于對(duì)照組下降至26.35%，50 μg·mL-1羅勒水提物處理的細(xì)胞存活率比模型組提高了59.40%。

3 討論

圖3 薄荷、羅勒提取物對(duì)HepG2 細(xì)胞的毒性Fig.3 Cytotoxicity of Mentha haplocalyx and Ocimum basilicum extracts to HepG2 cells

圖4 薄荷、羅勒提取物對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of Mentha haplocalyx and Ocimum basilicum extracts on alcoholic liver injury

本文采用DPPH、ABTS 自由基清除實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種唇形科植物水提物和醇提物的體外抗氧化能力，并通過體外HepG2 細(xì)胞模型測(cè)定其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，薄荷與羅勒的提取物具有較好抗氧化活性，其中薄荷提取物的抗氧化能力整體上優(yōu)于羅勒提取物，醇提物的抗氧化效果優(yōu)于水提物。薄荷水提物和醇提物對(duì)DPPH 自由基的清除效果較好，且EC50值相差不大，分別為75.77 μg·mL-1、70.42 μg·mL-1，薄荷醇提物對(duì)ABTS 自由基的清除效果更甚于陽性對(duì)照Vc，EC50值為9.04 μg·mL-1，顯示出極好的抗氧化能力。相比于DPPH 自由基的清除效果，羅勒水提物和醇提物對(duì)ABTS 自由基有更好的清除效果。薄荷和羅勒的抗氧化能力及差別可能主要?dú)w因于薄荷中揮發(fā)油、黃酮、多酚含量更高[1,22—24]。體外酒精肝損傷細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)表明，薄荷水提物、薄荷醇提物和羅勒水提物顯著地提高了酒精誘導(dǎo)后HepG2 細(xì)胞的存活率，且效果呈現(xiàn)劑量依賴性，但羅勒醇提物沒有明顯的效果。在酒精性肝損傷發(fā)生、發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等因素起著重要推動(dòng)作用[25]。薄荷和羅勒提取物的抗氧化能力，可能有助于減輕酒精性肝損傷過程中的氧化應(yīng)激程度，但薄荷和羅勒提取物的保肝功效可能并不完全依賴其抗氧化能力，其保肝機(jī)制有待進(jìn)一步研究。