樊乃境,王冬梅,高悅,郭亞男,程天賦,房慶喜,范志軍*
1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱,150030)2(黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司,黑龍江 佳木斯,154000)
免疫能力低下是一種暫時性或永久性免疫功能障礙狀態(tài),并且由于免疫系統(tǒng)遭到破壞,機體對病原體和外界刺激更加敏感,極大地危害人體健康。因此,通過一些切實可行的措施,提高機體免疫力,增強機體免疫功能,是營養(yǎng)學(xué)家和醫(yī)務(wù)工作者目前面臨的且急需解決的重大課題。目前,常采用免疫增強劑進(jìn)行調(diào)節(jié)機體免疫能力,如左旋咪唑、卡介苗、糖皮質(zhì)激素等。但此類藥物具有毒副作用強和生產(chǎn)成本高的缺陷,并且大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)藥物并不適用于慢性或預(yù)防性的用途[1]??茖W(xué)家們正在積極尋求和研究天然、安全的保證身體健康以及調(diào)節(jié)人體疲勞、增強免疫力的保健功能食品。在眾多的保健功能食品研究中,蛋白肽不乏是重點研究對象之一,尤其是在水解形成多肽后的保健效果已被科學(xué)家廣泛確認(rèn)。
免疫活性肽是一類能促進(jìn)和激活人體免疫能力的小分子活性肽,隨著人們對免疫活性肽研究的關(guān)注和深入,其發(fā)揮免疫功效的機理和結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系將被揭開。目前已經(jīng)在臨床上將免疫活性肽研發(fā)成免疫調(diào)節(jié)劑,用于治療免疫缺陷疾病或者是自身免疫性疾病等[2-3],具有廣闊的應(yīng)用前景。目前,從谷物蛋白[4]、豆類蛋白[5]、牛奶蛋白[6]、魚蛋白[7]、小麥蛋白[8]和貝類蛋白[9]中分離的肽已用于改善免疫功能低下的動物和患者的免疫功能。研究表明,食源性免疫活性肽對特異性和非特異性免疫應(yīng)答均能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,但是關(guān)于免疫活性肽對免疫系統(tǒng)組織學(xué)基礎(chǔ)的調(diào)控作用缺乏系統(tǒng)的研究[2,4-7]。
山藥是一種藥食同源的食材,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂血壓和體內(nèi)酸堿平衡等功效[10]。目前,對山藥功能因子的研究多集中在山藥多糖和糖蛋白的提取純化[11-13]及其生物活性[14],如分離出的糖蛋白組分CYG1和CYG2具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用[14]。但山藥蛋白質(zhì)中的氨基酸種類極為豐富,含有人體所必需的8種氨基酸且占總量25.32%,氨基酸評分、化學(xué)評分、營養(yǎng)指數(shù)等指標(biāo)也均高于大豆分離蛋白和玉米蛋白,這些均說明了山藥蛋白是一種營養(yǎng)價值極高的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源[15]。目前關(guān)于山藥蛋白的研究較少,關(guān)于山藥蛋白肽的研究僅限于水解工藝的優(yōu)化[16-18]及山藥多肽啤酒[15]的制備工藝。因此,本實驗采用隔天皮下注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫能力低下小鼠模型,通過口腔灌胃低、中、高不同劑量的山藥蛋白肽,并與空白對照組、陰性對照組相比較,從機體免疫系統(tǒng)(免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì))進(jìn)行探討山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,以期為山藥蛋白肽免疫活性的深入研究及深度開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
1.1.1 實驗動物
SPF(Specitic pathogen tree)級昆明種小鼠,雌雄各半,體重(25±2)g。
1.1.2 試劑
山藥蛋白肽,實驗室自制,水解度42.5%;山藥蛋白,實驗室自制,蛋白純度93.2%;鐵棍山藥,產(chǎn)地河南焦作;注射用環(huán)磷酰胺(cyclophos phamide,CY),江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H32020857;鹽酸左旋咪唑片(LH),廣西南國藥業(yè)有限公司;胎牛血清,Hyclone;DMEM培養(yǎng)基、胰酶,Gibco;青霉素-鏈霉素溶液,碧云天生物技術(shù)有限公司;PBS,索萊寶生物科技有限公司;LPS,Biosharp;切片用石蠟,山東寶麗來有限公司;蘇木精染色素,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;伊紅染色素,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;乳酸脫氫酶測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;酸性磷酸酶測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;無水碳酸鈉,汕頭市西隴化工廠有限公司;亞硝酸鈉,衡陽市凱信化工試劑有限公司;鈉石灰,上海納輝干燥試劑廠;小鼠IL-1α、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司。
1.1.3 儀器與設(shè)備
HF-90 CO2恒溫培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司;AE31倒置顯微鏡,麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司;SW-CJ-IF 型超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;MEK-7222血細(xì)胞分析儀,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;LEICA RM2235 石蠟切片機,德國徠卡有限公司;101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱,上海東星建材實驗設(shè)備有限公司;BD-326型臥式冷凍冰柜,青島海爾冷凍總公司。
1.2.1 山藥蛋白肽的制備
山藥蛋白肽制備工藝:
山藥蛋白→加水(底物濃度為7%)→加熱處理(95 ℃、10 min)→冷卻→調(diào) pH 10,溫度50 ℃→加7%胰蛋白酶→恒溫恒pH水解4.5 h→滅酶(95 ℃、10 min)→冷卻→調(diào) pH 9,溫度60 ℃→加7%堿性蛋白酶→恒溫恒pH水解3 h→滅酶(95 ℃、10 min)透析脫鹽12 h→冷凍干燥→山藥蛋白肽(水解度為42.48%)
1.2.2 山藥蛋白肽的氨基酸組成分析
稱取一定質(zhì)量的山藥蛋白肽置于水解管中,加入6 mol/L 10 mL鹽酸溶液,重復(fù)抽取真空充NL后封口,置于110 ℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h,取出冷卻后過濾,將濾液定容至50 mL,準(zhǔn)確吸取1 mL,于50 ℃真空干燥后采用蒸餾水溶解過濾,采用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。
1.2.3 動物分組及給藥
將小鼠隨機分為6組,具體給藥方法如表1所示。每組每天灌胃(ig)給藥,連續(xù)灌胃給藥10 d,同時,除正常對照組外,其余各組隔天皮下注射(Sc)環(huán)磷酰胺制造免疫能力低下小鼠模型。
表1 動物實驗分組及給藥情況
1.2.4 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫器官的影響
1.2.4.1 體重及免疫器官指數(shù)測定
末次給藥后予小鼠禁食12 h,宰殺前進(jìn)行稱體重并記錄,頸椎脫臼法處死,分別取胸腺和脾臟稱濕重,如公式(1)、公式(2)所示計算小鼠胸腺、脾臟指數(shù):
(1)
(2)
1.2.4.2 脾臟病理學(xué)切片測定
取完好無損的同一部位脾臟用PBS緩沖液洗凈,儲存于10%中性多聚甲醛溶液中固定,橫切一塊脾臟組織,不同濃度乙醇常規(guī)脫水后石蠟包埋,切3 mm切片于溫水浴中展平,平鋪于載玻片上置于37 ℃恒溫箱過夜后在4 ℃冰箱內(nèi)保存,HE染色鏡檢觀察。
1.2.5 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫細(xì)胞的影響
1.2.5.1 腹腔巨噬細(xì)胞中乳酸脫氫酶(lactic dehtdrogenase,LDH)及酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACPase)活性的測定
將小鼠脾臟器官采用4 ℃的生理鹽水沖洗干凈,置于15 mL的離心管中,并加入相當(dāng)于小鼠脾臟19倍重量的生理鹽水,在4 ℃下將離心管充分勻漿,制成5%脾臟組織液,3 000 r/min離心10 min,取上清液備用,按照說明書方法進(jìn)行檢測LDH、ACPase酶活性。
1.2.5.2 對免疫能力低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響
末次給藥1 h后處死動物,75%酒精浸泡5 min,無菌環(huán)境中取出脾臟,剪碎后過200目醫(yī)用紗布,收集得到脾細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,取細(xì)胞沉淀,加4 mL紅細(xì)胞裂解液吹打均勻,室溫靜置5 min后,1 000 r/min離心5 min,取沉淀采用4 mL PBS洗滌3遍,重懸中含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,去除貼壁細(xì)胞,懸浮的細(xì)胞為脾淋巴細(xì)胞,然后按5×106/孔密度接種于6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞按照1×104/孔密度接種于96孔板,按照試驗分組進(jìn)行培養(yǎng)12 h后,按照說明書采用WST-1法檢測細(xì)胞增殖率。
1.2.6 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫活性物質(zhì)的影響
1.2.6.1 對免疫能力低下小鼠血清IL-1α、IL-6、IFN-γ含量的影響
末次給藥后,小鼠禁食12 h,小鼠眼框采取50 μL,采用ELISA法進(jìn)行檢測IL-1α、IL-6、IFN-γ含量。
1.2.6.2 對免疫能力低下小鼠血清IgM、IgG含量的影響
末次給藥后,小鼠禁食12h,小鼠眼框采取50 μL,采用ELISA法進(jìn)行檢測IgM、IgG含量。
1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法
每組實驗平行測定至少3次,實驗結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差,利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析,并采用Duncan法進(jìn)行組間比較,P<0.05表示差異顯著,采用Origin 8.5 對數(shù)據(jù)結(jié)果作圖。
山藥蛋白肽的氨基酸組成分析見表2。
由表2可知,山藥蛋白肽(iron yam peptides,IYPs)的氨基酸組成中谷氨酸含量最高可達(dá)18.73%,其次是天冬氨酸和亮氨酸,且疏水性氨基酸(37.6%)和堿性氨基酸(17.6%)共占55.2%。這表明山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和極性氨基酸。
表2 山藥蛋白肽的氨基酸組成分析
2.2.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠體重的影響
山藥蛋白肽對各組小鼠體重增長率的影響結(jié)果見表3。
表3 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠體重的影響
體重增長率能直接或間接反映出機體健康狀況。小鼠體重增長率的下降也是免疫能力低下模型造模成功的標(biāo)志[19-20]。由表3可知,與正常組相比,其他組別的體重增長率均有不同程度的下降,這表明免疫能力低下小鼠模型構(gòu)建成功;山藥蛋白肽低、中、高劑量組較陰性模型組的體重增長率均有所上升,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。這說明山藥蛋白肽對CY所導(dǎo)致的體重下降具有一定的恢復(fù)作用,可以改善免疫能力低下引起的體重下降。
2.2.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫器官的影響
山藥蛋白肽對各組小鼠免疫器官指數(shù)的影響結(jié)果見表4。
表4 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠的免疫器官指數(shù)影響
注:*為與陰性對照組差異顯著,且P<0.05;#為與正常對照組差異顯著,且P<0.05(下同)
機體免疫器官的發(fā)育和狀態(tài)直接決定著免疫系統(tǒng)的應(yīng)答能力[21-22]。目前,免疫器官指數(shù)是反映和評價機體免疫系統(tǒng)和免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[23]。由表4可知,與正常組相比,模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著下降,說明CY能抑制小鼠免疫器官的發(fā)育并誘發(fā)免疫器官發(fā)生萎縮;與CY陰性對照組相比,山藥蛋白肽低、中、高劑量組的小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度的改善,且呈現(xiàn)量效關(guān)系,山藥蛋白肽高劑量組和正常組的胸腺指數(shù)并無顯著性差異(P>0.05)。這表明山藥蛋白肽能明顯緩解CY構(gòu)建的免疫能力低下小鼠免疫器官的萎縮,并促進(jìn)其發(fā)育,增強免疫能力。
2.2.3 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟病理學(xué)切片的影響
脾臟是機體最大的淋巴器官,也是血液循環(huán)中的過濾器官,按組織結(jié)構(gòu)可分為白髓和紅髓兩部分[24]。白髓是T、B淋巴細(xì)胞的集中之處,主要發(fā)揮防御外界微生物感染的作用。紅髓位于白髓周圍,由脾索和脾竇組成,能夠發(fā)揮過濾血液、清除凋亡細(xì)胞和吞噬病原體的功能[25]。脾臟發(fā)揮生物功能的基礎(chǔ)是完整、正常的網(wǎng)狀組織結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果顯示正常組脾臟結(jié)構(gòu)中的紅髓和白髓的界限明顯,脾索所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均勻,所圍成的脾竇分布均勻,在光鏡下無肉眼可見的病理變化;陰性對照組脾臟結(jié)構(gòu)的紅髓和白髓界限消失,脾索所圍成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞,幾乎變成了單一的組織細(xì)胞,脾竇明顯變大;與陰性對照組相比,山藥蛋白肽低劑量組的脾臟網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),但是仍存在脾竇增大,紅髓白髓界限明顯;山藥蛋白肽中劑量組的脾臟網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為明顯,脾竇變窄,紅髓白髓界限清晰;山藥蛋白肽高劑量組的脾臟結(jié)構(gòu)中紅髓白髓界限清晰,脾索所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為質(zhì)密均勻,脾竇分布較為均勻。結(jié)果表明山藥蛋白肽對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠脾臟的病理變化有顯著的改善作用,并呈現(xiàn)量效關(guān)系。
2.3.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響
山藥蛋白肽對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LDH和ACPase酶活性的影響結(jié)果見表5。
表5 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟LDH、ACPase活性的影響
乳酸脫氫酶活性直接影響機體胞內(nèi)細(xì)胞糖酵解釋放能量的速率[26]。巨噬細(xì)胞吞噬作用所需的能量也來源于糖酵解,并且LDH催化糖酵解的過程中會產(chǎn)生大量的乳酸,從而引起巨噬細(xì)胞胞內(nèi)pH值下降,有利于巨噬細(xì)胞胞內(nèi)免疫活性物質(zhì)和免疫功能的應(yīng)答[27]。酸性磷酸酶是高等動物巨噬細(xì)胞中溶酶體酶系的標(biāo)志酶之一[28]。當(dāng)外界病原體入侵機體時,巨噬細(xì)胞能發(fā)揮識別功能并啟動免疫應(yīng)答機制吞噬病原體進(jìn)行胞內(nèi)裂解,而以ACPase為主的溶菌體酶是發(fā)揮胞內(nèi)裂解的主要物質(zhì)[29]。因此,LDH和ACPase酶是巨噬細(xì)胞活力的標(biāo)志酶,其活性反映了巨噬細(xì)胞的活化能力和非特異性免疫水平。由表5可知,與正常組相比,陰性對照組的LDH、ACPase酶活性顯著降低(P<0.05),表明環(huán)磷酰胺對腹腔巨噬細(xì)胞中的LDH、ACPase酶活性有顯著的抑制作用;與模型組相比,山藥蛋白肽中、高劑量組均可顯著提高脾臟中LDH酶活性(P<0.05),并且山藥蛋白肽高劑量組的脾臟LDH酶活力和正常組無顯著性差異(P>0.05);山藥蛋白肽高劑量組可顯著提高脾臟中ACPase酶活性(P<0.05)。結(jié)果表明山藥蛋白肽可以在一定程度上緩解免疫能力低下小鼠脾臟中LDH、ACPase酶活性的降低,提高巨噬細(xì)胞活力,從而增強免疫能力。
2.3.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響
山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果見圖1。
圖1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響
淋巴細(xì)胞增殖是細(xì)胞免疫和體液免疫級聯(lián)反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)。淋巴細(xì)胞的增殖能力在一定程度上反映了淋巴細(xì)胞功能的高低,也一定程度體現(xiàn)了機體體液免疫的能力[30]。由圖1可知,與正常組相比,CY陰性對照組的淋巴細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05);與CY陰性對照組相比,山藥蛋白肽低、中、高劑量組可以顯著提升淋巴細(xì)胞增殖能力(P<0.05),并且山藥蛋白肽高劑量組和正常組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導(dǎo)致的免疫能力低下小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的降低,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。
2.4.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠白介素水平的影響
山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清白介素水平的影響結(jié)果見表6。
表6 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清白介素水平的影響
IL-1α是IL-1家族中的典型代表之一,又稱淋巴細(xì)胞活化因子,在免疫和炎癥反應(yīng)及機體生長代謝方面有著不可或缺的功能[31]。IL-6是由機體多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白,主要作用的靶細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞,又稱為B細(xì)胞刺激因子。IFN-γ是特異性免疫的調(diào)節(jié)劑,能誘導(dǎo)Th0型細(xì)胞分化成Th1型細(xì)胞,并且能激活巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和清除胞內(nèi)病原體[32]。由表6可知,與正常組相比,CY陰性對照組的血清IL-1α、IL-6、IFN-γ均顯著下降(P<0.05),這表明CY可引起機體白介素水平的顯著下降,降低機體免疫防御能力;與陰性對照組相比,山藥蛋白肽中、高劑量組可以顯著提升IL-1α、IL-6、IFN-γ水平(P<0.05),且高劑量組IL-1α和IFN-γ水平和正常組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導(dǎo)致的免疫能力低下小鼠體內(nèi)白介素水平的降低,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。
2.4.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫球蛋白的影響
表7 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清IgG、IgM的影響
IgG是體液免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的主要抗體,約占血清中抗體總量的80%,具有抗菌、中和病毒及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[33]。IgM是機體初次免疫應(yīng)答中分泌最早的抗體,在抵御原發(fā)性感染的過程中發(fā)揮著重要作用[34]。由表7可知,與正常組相比,CY陰性對照組的IgG水平顯著下降(P<0.05),這說明CY可以抑制機體IgG、IgM的分泌和表達(dá);與CY陰性對照組相比,山藥蛋白肽低、中、高劑量組可以顯著提升IgG、IgM水平(P<0.05),且山藥蛋白肽高劑量組IgM水平和正常組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導(dǎo)致的免疫能力低下小鼠體內(nèi)免疫球蛋白水平的降低,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。
食源性肽的免疫活性受肽的氨基酸組成、序列、長度、電荷和結(jié)構(gòu)[35]所影響。AHN[36]和HE[37]的研究表明,肽的免疫學(xué)活性與其包含豐富的疏水性氨基酸有關(guān),這是因為疏水基團(tuán)可以和細(xì)胞膜相互作用,促使其免疫活性增強,且具有免疫活性的肽末端多是堿性的氨基酸。同時VO等[38]的研究表明當(dāng)肽鏈的氨基酸殘基上具有一個或多個谷氨酰胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸等時,能促進(jìn)食源性肽的免疫調(diào)節(jié)活性。因此,疏水性氨基酸和堿性氨基酸的含量高低對免疫活性具有重要的作用。通過氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和堿性氨基酸,且谷氨酸和天冬氨酸含量較高。這可能是山藥蛋白肽具有極佳免疫活性的構(gòu)效原因之一。
本課題采用隔天皮下注射CY制造免疫功能低下小鼠模型,通過口腔灌胃不同劑量的山藥蛋白肽,并與空白對照組、陰性對照組相比較,測定山藥蛋白肽的氨基酸組成及其對機體免疫系統(tǒng)(免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì))的影響。結(jié)果表明,山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和堿性氨基酸;且能提高CY誘導(dǎo)免疫能力低下小鼠的體重生長率、免疫器官指數(shù)和改善脾臟病理學(xué)變化;提高免疫能力低下小鼠體內(nèi)LDH酶、ACPase酶活性和脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力;同時能提高免疫能力低下小鼠的細(xì)胞因子(IL-1α、IL-6、IFN-γ)和免疫球蛋白(IgG、IgM)的水平,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。這表明山藥蛋白肽可以通過促進(jìn)免疫能力低下小鼠的中樞和外周免疫器官的發(fā)育、改善機體免疫細(xì)胞狀態(tài)、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫活性物質(zhì)的分泌表達(dá),提高機體免疫能力,發(fā)揮其免疫活性。