史 偉,李 慎,吳 瑞,張俊君,李 俊,高 濤,焦亞東,張 蕾,徐 藝,張少白,余鵬博

2013年長三角地區(qū)的上海市和安徽省先后報告H7N9流感病毒引起的人間感染病例，這也是全球首次報道的人類感染該亞型的流感病毒[1]。截至2017年4月，全球共報告1 344例人感染H7N9流感確診病例，其中死亡511人[2]。迄今為止，陜西省共報告7例人感染H7N9流感病例和2起禽間H7N9疫情。其中2017年5月，咸陽市一例重癥肺炎病例在西安被確診為H7N9病例，為陜西省首例H7N9流感病毒導致的人類感染病例[3]，此后又發(fā)現(xiàn)6例人感染病例[4]。

為評估H7N9流感病毒暴露風險，為防控工作提供科學依據(jù)，本研究對2017年5月至2018年3月陜西省H7N9流行分布和基因特性進行整理和分析。

1 材料與方法

1.1樣本采集 陜西省在每個地市均設(shè)有監(jiān)測點，長年開展外環(huán)境禽流感病原學監(jiān)測任務(wù)[5]。采樣方法參考《職業(yè)暴露人群血清學和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案(2011版)》[6]的要求，采集禽類糞便、禽類飲水、禽籠具表面擦拭等類型環(huán)境標本。

H7N9報告病例檢測及禽間疫情暴露環(huán)境監(jiān)測：按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案(第3版)》[7]和《人感染H7N9禽流感病毒標本采集及實驗室檢測策略》[8]進行樣本采集和流行病學調(diào)查。

1.2病毒檢測與毒株分離 待檢樣本暫存于4 ℃并于24 h內(nèi)送至當?shù)亓鞲芯W(wǎng)絡(luò)實驗室。核酸提取采用凱杰公司QIAamp Viral RNA Mini Kit (Cat No.52904)提取。所有樣本先開展甲型流感初篩，陽性樣本再進行H7亞型檢測。流感分型試劑由江蘇碩世生產(chǎn)。國家流感中心對陽性樣本進行復(fù)核和雞胚毒株分離，并對毒株利用Illumina平臺進行全基因組測序；PCR核酸檢測陽性但未分離出雞胚株的環(huán)境樣本直接進行測序[9]。測序結(jié)果上傳至中國流感病毒基因序列數(shù)據(jù)庫。

1.3病毒序列分析 采用MEGA X軟件[10]對核苷酸推導出的氨基酸序列進行位點變異比對并構(gòu)建遺傳進化樹，進化樹采用Neighboring-joining法進行繪制，Bootstrap重復(fù)值為1000。導出結(jié)果用FigTree進行美化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)。參考毒株的基因序列來自GISAID(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織數(shù)據(jù)庫)。

2 結(jié) 果

2.12017-2018年外環(huán)境H7N9病原監(jiān)測情況 2017年5月至2018年3月，陜西省142個監(jiān)測點共采集活禽市場外環(huán)境標本2 442份，檢出H7N9陽性標本12份，陽性率為4.91‰。

2.2H7N9報告病例及暴露環(huán)境監(jiān)測情況 陜西省共發(fā)現(xiàn)H7N9病例7例，其中包括：咸陽[3]和榆林的兩起聚集性病例，以及西安和寶雞報告的散發(fā)病例。其中5例發(fā)病前有活禽接觸史。

對所有本地病例暴露環(huán)境進行環(huán)境監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：咸陽采集環(huán)境樣本192份，結(jié)果均為陰性；西安采集環(huán)境樣本209份，H7N9陽性樣本11份；寶雞采集各類環(huán)境樣70份，H7N9陽性樣本3份。

另外，根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織報告，陜西省榆林市[11]和銅川市各發(fā)現(xiàn)1起禽間禽流感疫情。其中榆林市報告家禽死亡約2.2萬只，銅川市死亡蛋雞810只。具體信息和地理分布情況分別見表1和圖1。

表1 2017年至2018年陜西省H7N9標本基本信息及檢測結(jié)果Tab.1 Informations and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

注：*和**為聚集病例

注：圖例中雞/人(紅)代表感染高致病性H7N9，雞/人(黑)代表感染低致病性H7N9；雞頭向右代表樣本來自規(guī)?；B(yǎng)殖場，向左代表樣本來自活禽市場圖1 2017-2018年陜西省H7N9病毒變異株分布情況Fig.1 Distribution of H7N9 virus mutants in Shaanxi Province from 2017 to 2018

2.3陜西省H7N9流感病毒HA和NA核苷酸序列同源性分析 選擇A/Anhui/2013和A/Guangdong/17SF062/2017、H7N9重組疫苗株A/duck/Fujian/S4170/2014為參考株，運用MEGA X對上述14株病毒HA基因和NA基因同源性進行分析。陜西省分離的H7N9 HA基因核苷酸的同源性分別為99.17%～99.29%、99.28%～99.89%和96.44%～96.58%；NA基因核苷酸與上述H7N9流感病毒代表株的核苷酸的同源性為99.09%～99.24%、98.51%～98.67%、95.89%～96.27%。

2.4H7N9流感病毒種系進化樹分析 寶雞、榆林、西安、銅川分離毒株HA氨基酸發(fā)生插入突變?yōu)镻EVPKRKRTAR↓GLF，咸陽、西安、寶雞為PEIPKGR↓GLF。據(jù)報道，長江三角洲地區(qū)是公認的原始來源地，珠三角地區(qū)作為H7N9的額外暴發(fā)源[12]。從進化上將H7N9分為長江三角洲分支(Yangtze River Delta)和珠江三角洲分支(Pearl River Delta)，而陜西省分離到的毒株均屬于長江三角洲分支。陜西省所發(fā)現(xiàn)的H7N9高致病株HA序列與2016年底在廣東最早發(fā)現(xiàn)的高致病株高度同源，見圖2左圖所示。NA遺傳進化特點與HA一致，即陜西高致病性H7N9變異株與廣東2016高致病株NA基因高度同源。見圖2右圖所示。

圖2 2017-2018年陜西省H7N9流感病毒HA(左)和NA(右)進化樹Fig.2 Phylogenetic trees for HA (left)and NA(right) genes of the influenza H7N9 viruses in Shaanxi Province

2.5H7N9陜西株編碼蛋白關(guān)鍵氨基酸位點分析 結(jié)合表1信息和所有毒株核酸序列信息，對H7N9關(guān)鍵氨基酸位點發(fā)現(xiàn)：寶雞、榆林、西安、銅川分離毒株HA氨基酸發(fā)生插入突變?yōu)镻EVPKRKRTAR↓GLF，系高致病性H7N9流感病毒(High Pathogenic，HP)；咸陽、西安、寶雞為PEIPKGR↓GLF，系低致病性H7N9流感病毒(Low Pathogenic，LP)。部分病毒HA蛋白出現(xiàn)Q226L改變，提示這幾株病毒具有結(jié)合人類和禽類的雙受體結(jié)合特性。3株毒株P(guān)B2蛋白分別出現(xiàn)E627V或E627K改變，提示病毒發(fā)生與毒力增強相關(guān)的突變[13-15]。所有毒株P(guān)B1蛋白473V改變，提示在哺乳動物中的復(fù)制能力增強[16]；M1蛋白30和215位點均發(fā)生與毒力增強相關(guān)的突變[17]；M2蛋白S31N改變，提示所有毒株對烷胺類藥物耐藥[18]；NS1蛋白中80-84位點氨基酸未發(fā)生缺失[19]。詳見表2。

表2 2017年至2018年陜西省H7N9標本基本信息及檢測結(jié)果Tab.2 Information and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

3 討 論

人感染H7N9流感病毒是2013年首次被發(fā)現(xiàn)[1]，在之后數(shù)年在我國安徽、上海、浙江、福建、廣東等多省均有報道[2, 20]。陜西作為內(nèi)陸省份，外環(huán)境一直未監(jiān)測到[5]。直到2017年5月才報道首例人感染H7N9病例[3]。據(jù)報道，陜西省多個縣區(qū)開展活禽養(yǎng)殖業(yè)務(wù)[21]，人群暴露在病毒環(huán)境下的可能性較高。因此，評估人群暴露風險、研究本省H7N9禽流感病毒的分子特征至關(guān)重要。

2017年5月至2018年3月，陜西省142個活禽市場監(jiān)測點H7N9核酸陽性率為4.91‰，提示陜西省活禽市場整體污染狀況較低。但從H7N9病例追溯其接觸的活禽市場中環(huán)境樣本有病毒檢出，提示從業(yè)人員應(yīng)注意禽流感暴露的風險。

從進化來分析陜西14株H7N9流感病毒基因信息。它們與長三角地區(qū)的H7N9高度同源，但卻又分成低致病性和高致病性兩個分支，也反映了病毒來源的復(fù)雜性。這可能和兩方面原因有關(guān)：一方面陜西有豐富的自然資源，適宜鳥類的生存與遷徙[22-23]；另一方面，陜西地處交通要道，周邊省份發(fā)現(xiàn)H7N9病例后關(guān)閉活禽市場[24]，病禽很可能流通到本地。

編碼蛋白關(guān)鍵氨基酸位點序列分析發(fā)現(xiàn)：H7N9裂解位點的突變導致其對家禽致病力增強，給活禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。同時，HA蛋白Q226L突變增加了病毒對人α-2,6唾液酸受體結(jié)合力增強；PB1蛋白473V改變、PB2蛋白E627V/K改變、M1蛋白30D和215A均提示病毒致病力和對哺乳動物的適應(yīng)性在增強。M蛋白均發(fā)生S31N突變，提醒我們在臨床診療中選擇針對性的藥物[25]。

因此，為更好的防控H7N9流感，需要加強人H7N9流感疫情的檢測并密切關(guān)注病毒變異情況。規(guī)范活禽市場管理，加強禽類H7N9流感病毒的監(jiān)測和控制。

利益沖突：無

引用本文格式：史偉，李慎，吳瑞，等.2017-2018年陜西省H7N9禽流感病毒流行特征及基因進化分析[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：124-129. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.014