劉彩琴 魏興虎 王 楠 陳蔚青 陳 虹 呂 韻 鄭 剛

(1. 浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310015;2. 山東金得利食品有限公司,山東 濟(jì)寧 272200)

果汁營養(yǎng)豐富，但pH多為2.4～4.2[1]，其常見污染菌為耐熱、耐酸的霉菌、酵母菌和細(xì)菌[2-6]。耐熱細(xì)菌如酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Aliyclobacillusacidoterrestris)常引起巴氏滅菌果汁在常溫條件下濁度升高，是濃縮果汁生產(chǎn)中最重要的目標(biāo)控制微生物[7-8]；耐熱霉菌如多變擬青霉、尖孢鐮刀菌、絲衣霉、籃狀菌、新薩托菌和布氏正青霉、正青霉等常引起巴氏殺菌果汁的腐敗[1]；魯氏接合酵母、釀酒酵母、出芽短梗霉等是導(dǎo)致果汁腐敗變質(zhì)的酵母菌[9-10]。控制微生物污染一直是果汁工業(yè)努力解決的難題，不同的原料使加工工藝、果汁的糖度和酸度等不相同，耐熱微生物種類也不盡相同。

濃縮胡蘿卜汁是中國復(fù)合果汁飲料和酸奶加工中常用的原料，經(jīng)115～120 ℃殺菌處理30 s，其pH為6.0左右;為低酸性食品[11]，冷藏條件下極少出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。試驗(yàn)擬對某企業(yè)脹袋胡蘿卜濃縮汁中耐熱微生物進(jìn)行分離及特性研究，以期為胡蘿卜濃縮汁加工、保藏和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

胡蘿卜濃縮汁：-18 ℃保存，山東某果汁生產(chǎn)企業(yè)。

1.1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、各種生化管：杭州微生物試劑有限公司；

麥芽汁瓊脂(MEA)培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平：PL303型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，金壇市江南儀器廠；

酸度計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：GR60DA型，致微儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)： HJ-VD-650型，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

搖床：SW-CJ-1C型，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

生物顯微鏡：YS100型，尼康儀器(上海)有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-2D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UVmini-1240型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 耐熱菌的分離及純化

(1) 耐熱菌的富集培養(yǎng)：參照胡貽椿等[12]的方法并進(jìn)行修改。吸取50 mL無菌樣品，加入250 mL無菌三角燒瓶中，80 ℃水浴13 min，然后迅速冷卻至45 ℃，以150 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

(2) 分離及純化：將培養(yǎng)后的樣品用無菌生理鹽水分別稀釋至10-1，10-2，…，10-8。吸取濃度為10-7，10-8梯度的樣液200 μL，涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)2～5 d，挑取典型單菌落，保藏并備用。

1.2.2 耐熱菌的形態(tài)及理化特性

(1) 菌株形態(tài)：純化后的菌株接種于MEA平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)。

(2) 碳源利用情況：按D-葡萄糖、甘油、D-木糖、側(cè)金盞花醇、肌醇、山梨醇、纖維二糖、D-乳糖(牛源)、海藻糖、D-松三糖、木糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、D-麥芽糖、α-甲基-D-葡萄糖、D-棉籽糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、D-蔗糖生化鑒定管的要求接種耐熱菌，考察菌株對碳源的利用情況。

(3) 菌株的耐熱性：菌株經(jīng)液體培養(yǎng)72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，取適量稀釋液于80，90 ℃水浴鍋中分別水浴5，10，15，20，25，30 min。分別涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，觀察生長情況。

(4) 菌株的耐酸特性：將液體培養(yǎng)72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，分別接種于pH為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的PDA培養(yǎng)基上(1 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié))，于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，觀察生長情況。

1.2.3 耐熱菌的鑒定 由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行分子鑒定。

1.2.4 超聲波功率對耐熱菌色素提取效果的影響 參照葉偉慶等[13]的方法并進(jìn)行修改。取適量培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液，5 000 r/min離心15 min，沉淀經(jīng)蒸餾水清洗3次，得濕菌泥1 g，加入 3 mol/L HCl 溶液10 mL，于200，400，600，800 W下超聲1 h(每超聲5 s間隔10 s)，沸水浴10 min，再用冰水浴速冷，5 000 r/min離心15 min，得到上清液和紅色沉淀。

(1) 還原糖和多糖含量的測定：分別采用DNS法[14]和苯酚硫酸法[14]測定上清液中還原糖和多糖含量。

(2) 吸光度值的測定：紅色沉淀經(jīng)蒸餾水清洗3次后，加入10 mL丙酮溶液浸提12 h，離心取紅色上清液，于400～800 nm下測定吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均為3次平行，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件分析；采用MEGA 5.0軟件，鄰近連接法分析“SR-1”與相關(guān)種的ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱菌的形態(tài)及理化特性

2.1.1 菌株形態(tài) 通過分離、篩選及純化，得到1株經(jīng)85 ℃水浴30 min后長勢良好的粉紅色菌株SR-1。由圖1可知，SR-1在MEA培養(yǎng)基上呈奶油狀，粉紅色，表面反光，邊緣整齊，菌落平伏，不透明。由圖2可知，SR-1菌株在顯微鏡下細(xì)胞呈腎形，芽殖，大小為3.0～13.0 μm×3.0～5.0 μm。綜上，菌株SR-1為酵母菌，與文獻(xiàn)[15-16]中擲孢酵母屬特征相近，孢子形狀與王啟明等[17]報(bào)道的腎形相似，初步判定為擲孢酵母。

圖1 SR-1的菌落形態(tài)

圖2 SR-1的細(xì)胞形態(tài)

2.1.2 碳源利用情況 由表1可知，菌株SR-1可利用單糖如D-葡萄糖，能利用二糖如海藻糖、D-麥芽糖、D-蔗糖，能利用三糖如D-松三糖、D-棉籽糖，也能利用山梨醇，但不能利用甘油、D-木糖、側(cè)金盞花醇、肌醇、纖維二糖、D-乳糖(牛源)、木糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、α-甲基-D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺，與已報(bào)道[16]的擲孢酵母對碳源的利用情況不一致，與Yang等[18]的肉色擲孢酵母對D-木糖、纖維二糖和側(cè)金盞花醇利用情況不同。

表1 菌株SR-1對部分碳源的利用情況?

? “+”代表反應(yīng)陽性；“-”代表反應(yīng)陰性。

2.1.3 耐熱耐酸特性 由表2可知，菌株SR-1經(jīng)80 ℃水浴5，10，15，20，25，30 min后均在PDA培養(yǎng)基上生長良好；經(jīng)90 ℃水浴5 min后能較好生長，水浴10，15 min后有生長，但長勢不良，水浴20，25，30 min后不再生長，說明SR-1較耐熱。由表3可知，菌株SR-1在pH 6.0～8.0下生長良好，在pH 4.0，5.0下能生長，但長勢不好，在pH<3.0時(shí)不能生長，表明菌株SR-1在pH 3.0以下的強(qiáng)酸性環(huán)境中不能生長，但在pH 4.0以上均能生長，且在中性及偏堿性環(huán)境中生長良好，與溫洪宇等[19]的結(jié)論相似。

2.2 菌株SR-1的ITS rDNA序列及分析

提取菌株SR-1的DNA，設(shè)計(jì)引物并PCR擴(kuò)增，得到最終的ITS rDNA序列，序列長度為550 bp。由圖3可知，SR-1與擲孢酵母屬(Sporobolomyces)中的模式菌株SporobolomycescarnicolorJCM 3766T(登錄號(hào)為AY069991)聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，表明其親緣關(guān)系最近。故將菌株SR-1命名為肉色擲孢酵母(Sporobolomycescarnicolor)SR-1。

表2 菌株SR-1的耐熱特性?

? “+++”代表生長良好；“++”代表生長較好；

“+”代表生長；“-”代表不生長。

表3 菌株SR-1的耐酸特性?

? “+++”代表生長良好；“++”代表生長較好；“+”代表生長；“-”代表不生長。

2.3 超聲波功率對菌株SR-1色素提取效果的影響

由圖4可知，菌株SR-1上清液還原糖含量為6.02～7.86 mg/mL，多糖含量為32.93～41.78 mg/mL。當(dāng)超聲功率為600 W時(shí)，還原糖含量最高；當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，多糖含量最高。酵母胞內(nèi)還原糖主要來源于細(xì)胞質(zhì)中還原性糖類，如葡萄糖、果糖等，適度的超聲處理有利于其釋放；酵母胞內(nèi)多糖主要來源于細(xì)胞壁中的葡聚糖和甘露聚糖等多糖[20]，適度的破壁處理可使多糖充分釋放；與王慧等[21]研究結(jié)果類似。

由圖5可知，當(dāng)超聲功率為200，400，600 W時(shí)，菌體的丙酮提取液在414.0，539.0，634.0 nm處各有3個(gè)吸收峰，以539 nm處吸收峰值最大；當(dāng)超聲功率為800 W時(shí)，丙酮提取液在414 nm處無吸收峰，在539，634 nm處各有一吸收峰，仍以539 nm處吸收峰值最大?，F(xiàn)有資料[22]顯示，β-胡蘿卜素的吸收峰為430，450，475 nm，圓酵母素的吸收峰為459，482，515 nm，紅酵母紅素的吸收峰為470，492，521 nm，與試驗(yàn)結(jié)果不同。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從產(chǎn)氣、脹袋的胡蘿卜濃縮汁中分離出一株耐熱菌SR-1，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS rDNA 基因序列分析為酵母菌屬的肉色擲孢酵母，該菌經(jīng)80 ℃熱處理5～30 min和90 ℃熱處理15 min以下均可生長，經(jīng)90 ℃熱處理20 min后不能生長；在pH 6.0～8.0環(huán)境中生長良好，在pH 3.0以下不生長。以鹽酸為溶劑輔以超聲波破壁技術(shù)，有利于菌株還原糖、多糖和色素的溶出，肉色擲孢酵母SR-1丙酮提取液吸收峰為414，539，634 nm。擲孢酵母SR-1對碳源的利用情況和色素吸收峰仍需進(jìn)一步研究。

圖3 菌株SR-1的ITS rDNA基因序列分析聚類結(jié)果

圖4 超聲功率對菌株SR-1多糖和還原糖含量的影響

圖5 超聲功率對菌株SR-1色素提取效果的影響