劉倩妤 唐書澤 李 梁 杜文琪 滕久委

(1. 暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2. 暨南大學國際學院，廣東 廣州 510632)

城市居民飲水一般來自家庭廚房龍頭的自來水，需經(jīng)水源地(河流、地下、水庫等)取水，輸水管網(wǎng)輸水，水處理廠制水(凈化、沉淀、過濾、消毒)，水源配送(硬質(zhì)塑膠PVC 管、鋼塑混合管或涂層鋼管)配水，最終到達用戶水龍頭用水等環(huán)節(jié)[1]。出來的水分別稱為水源水、進廠水、水處理過程水、管網(wǎng)水和家庭龍頭自來水。正常狀態(tài)下，家庭龍頭自來水的安全和質(zhì)量因為有這些關鍵處理環(huán)節(jié)能夠得到充分保障。但受水源環(huán)境污染、水處理技術差異、供水輸水管網(wǎng)材質(zhì)以及人為投毒、缺乏預警的影響，城市飲水突發(fā)污染應急情況難以完全避免。最近發(fā)表的1篇關于美國龍頭水安全性的調(diào)查報告[2]指出，65%的受訪者認為龍頭水不如瓶裝水安全，69%的受訪者認為如果龍頭水的安全性能夠得到保障，則不會購買瓶裝水。利用供水系統(tǒng)投毒事件也時有發(fā)生[3-5]。這給城市飲水安全預警研究提出了新課題。

毒黃素是一種可由椰毒假單胞菌、莢殼伯克霍爾德氏菌、水稻細菌性谷枯病菌等多種細菌產(chǎn)生的小分子類細菌外毒素[6]。毒黃素小鼠靜脈注射LD501.7 mg/kg，口服LD508.4 mg/kg，溶于水，易在通氣條件下產(chǎn)生，常見于被污染的發(fā)酵米面及變質(zhì)銀耳等食品原料中，屬于易被忽視但容易獲取的生物化學毒劑。

毒黃素的檢測方法主要有薄層色譜法[7]、高效液相色譜—質(zhì)譜法[8]、分光光度法[9]、高效液相色譜法[10]、生物傳感測定法等[11]。這些方法存在設備昂貴，操作復雜，重復性較差，耗時較久，不能實時在線監(jiān)測等缺陷。流動注射化學發(fā)光法具有檢測限低，靈敏度高，檢測迅速，線性范圍寬，可連續(xù)進樣從而實現(xiàn)在線監(jiān)測等優(yōu)點[12-13]。目前已研究開發(fā)了黃綠青霉素[14]、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[15]、赭曲霉毒素A[16]等生物化學毒劑的流動注射化學發(fā)光快速在線監(jiān)測方法，但毒黃素流動注射化學發(fā)光快速在線監(jiān)測方法未見報道。試驗基于毒黃素對魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅體系化學發(fā)光強度的抑制作用，擬建立一種針對飲水中毒黃素突發(fā)性污染的在線監(jiān)測新方法，期望能應用于城市飲水安全預警防恐。

1 材料與方法

1.1 主要設備與試劑

1.1.1 主要設備

微弱發(fā)光測量儀：BPCL-K型，北京亞泊斯科技有限公司；

六通閥：CHEMINERT C22Z-3186型，美國VICI公司；

蠕動泵：BT100-1F型，保定蘭格恒流泵有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-3600Plus型，日本島津有限公司。

1.1.2 主要試劑

魯米諾標準品：Cas號521-31-3，純度98%，美國Sigma公司；

過氧化氫溶液：Cas號7722-84-1(51501)，純度30%，廣州市信洪貿(mào)易有限公司；

納米氧化銅分散液：純度30%，宣城晶瑞新材料有限公司；

毒黃素標準品：Cas號84-82-2，純度≥98%，廣州菲博(寶匯)生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 進樣方法 流動注射化學發(fā)光原理如圖1所示，通道a～d分別加入魯米諾溶液、毒黃素溶液、過氧化氫溶液和納米氧化銅溶液。4個通道均由P處蠕動泵給予推動力，當溶液流至六通閥時再對六通閥進行調(diào)節(jié)，使各管道內(nèi)的溶液混合反應產(chǎn)生熒光，熒光信號再由光電倍增管捕捉，最終光信號由信號分析器轉(zhuǎn)化為電信號，再由計算機記錄下來并對其進行分析。

1.2.2 化學發(fā)光動力學特征曲線 納米氧化銅可作為該發(fā)光體系的光增敏劑[17-18]，通過觀察對比納米氧化銅對化學發(fā)光體系光強的增敏作用、毒黃素對體系光強的抑制作用以及魯米諾—過氧化氫體系化學發(fā)光光強，繪制動力學曲線。

a. 魯米諾溶液 b. 毒黃素溶液 c. 過氧化氫溶液 d. 納米氧化銅溶液 P. 蠕動泵 V. 六通閥 F. 流通池 W. 廢液PMT. 光電倍增管 NHV. 負高壓 PC. 電腦

圖1 流動注射化學發(fā)光原理圖

Figure 1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence system

1.2.3 檢測條件的優(yōu)化 試驗中毒黃素濃度控制為0.01 mg/L。

(1) 魯米諾濃度對發(fā)光強度的影響：在氫氧化鈉濃度0.04 mol/L，過氧化氫濃度0.60 mol/L，納米氧化銅濃度140 mg/L的條件下，分別考察魯米諾濃度為1.2，2.4，3.6，4.8，6.0，7.2，8.4 mmol/L時體系化學發(fā)光強度。

(2) 氫氧化鈉濃度對發(fā)光強度的影響：在魯米諾濃度4.8 mmol/L，過氧化氫濃度0.60 mol/L，納米氧化銅濃度140 mg/L的條件下，分別考察氫氧化鈉濃度為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，1.00 mol/L時體系化學發(fā)光強度。

(3) 過氧化氫濃度對發(fā)光強度的影響：在魯米諾濃度4.8 mmol/L，氫氧化鈉濃度0.04 mol/L，納米氧化銅濃度140 mg/L的條件下，分別考察過氧化氫濃度為0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mol/L時體系化學發(fā)光強度。

(4) 納米氧化銅濃度對發(fā)光強度的影響：在魯米諾濃度4.8 mmol/L，氫氧化鈉濃度0.04 mol/L，過氧化氫濃度0.60 mol/L的條件下，分別考察納米氧化銅濃度為20，60，100，140，180，220 mg/L時體系化學發(fā)光強度。

(5) 響應面優(yōu)化：基于單因素試驗結(jié)果，利用響應面法設計四因素三水平的優(yōu)化試驗，以得到最佳檢測條件。

1.2.4 共存物干擾試驗 飲水中常見的一些離子如Ca2+、Mg2+、Na+等可能對光強測定有干擾作用[19-21]。在響應面優(yōu)化的最佳試驗條件下，控制毒黃素濃度0.1 mg/L，允許其他離子對光強測定的影響不超過±5%時，評估飲水中一些可能的共存離子對毒黃素測定的影響。

1.2.5 標準曲線、精密度與檢出限 在響應面法得出的最佳試驗條件下，考察毒黃素濃度在0.005～5.000 mg/L時體系化學發(fā)光強度。將毒黃素濃度和化學發(fā)光強度分別作為橫、縱坐標，繪制毒黃素測定的標準曲線并計算精密度與檢出限。

1.2.6 加標回收測定 在響應面法得出的最佳試驗條件下，分別在某品牌瓶裝水(NF)、宿舍桶裝水以及蒸餾水中加入0.05，4.00 mg/L毒黃素，測定回收率。

1.2.7 反應機理探討 為探討可能的反應機理，利用紫外分光光度計，設置波長200～500 nm，分別對魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅—毒黃素、魯米諾—毒黃素、魯米諾—過氧化氫、魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅、過氧化氫—毒黃素、納米氧化銅—毒黃素、毒黃素、過氧化氫、納米氧化銅9種溶液進行紫外吸收光譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學發(fā)光動力學特征曲線

圖2為不同混合溶液的化學發(fā)光動力學特征曲線。對比分析魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅和魯米諾—過氧化氫曲線，可知納米氧化銅對魯米諾—過氧化氫發(fā)光體系有顯著促進發(fā)光作用。在此基礎上對比分析魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅—毒黃素和魯米諾—過氧化氫—毒黃素曲線可知，納米氧化銅對加入毒黃素后的魯米諾—過氧化氫體系仍有相同作用，并且在以上兩組對比中，納米氧化銅的加入并未改變反應時間，說明納米氧化銅可作為化學發(fā)光體系中的光增敏劑。

觀察魯米諾—過氧化氫和魯米諾—過氧化氫—毒黃素曲線、魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅和魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅—毒黃素曲線，可以看出毒黃素可以顯著抑制魯米諾—過氧化氫體系及魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅體系的光強。因此，選擇用魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅體系來檢測毒黃素。

2.2 檢測條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結(jié)果 由圖3可知，魯米諾最佳濃度為4.8 mmol/L，氫氧化鈉最佳濃度為0.04 mol/L，過氧化氫最佳濃度為0.6 mol/L，納米氧化銅最佳濃度為140 mg/L。

圖2 化學發(fā)光動力學特征曲線

圖3 魯米諾、氫氧化鈉、過氧化氫及納米氧化銅4種化合物濃度對化學發(fā)光強度的影響

Figure 3 The influence of the concentration of luminol, sodium hydroxide, hydrogen peroxide and copper oxide nanoparticles on the chemiluminescence intensity

2.2.2 響應面模型建立 以魯米諾濃度、氫氧化鈉濃度、過氧化氫濃度、納米氧化銅濃度為自變量，以化學發(fā)光強度為因變量，進行響應面優(yōu)化試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計因素水平見表1。試驗方案和結(jié)果見表2。

表1 響應面優(yōu)化試驗的因素和水平

2.2.3 模型擬合及回歸方程分析 回歸擬合后，化學發(fā)光強度和各因素之間的多元二次回歸方程：

y=1.387×105-966.75A+3 138.25B+4 499.50C+4 150.83D+662.75AB+3790.50AC-43.00AD-5 364.25BC-899.75BD+326.25CD-5 683.62A2-2 190.62B2-5 563.75C2-4 244.00D2。

(1)

表3顯示，模型顯著水平P<0.000 1，表明模型可用于優(yōu)化試驗設計。失擬項P=0.303 2，不顯著，表明得到的多元二次回歸方程可用于擬合大部分試驗結(jié)果，擬合效果佳。所以該模型可用于體系化學發(fā)光的優(yōu)化。其中B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2差異均具有極顯著性，表明顯示的差別是由偶然性所致的可能性不足1%，結(jié)果可靠性極高。

表2 響應面優(yōu)化試驗的方案和結(jié)果

圖4為各因素交互作用的響應面分析結(jié)果，其中AB、AC、AD響應曲面較陡峭，且觀察到其投影下的等高線呈橢圓形，表明魯米諾濃度與氫氧化鈉濃度、過氧化氫濃度與氫氧化鈉濃度、納米氧化銅濃度與氫氧化鈉濃度均有一定交互作用。而觀察BD、BC、CD的等高線可知其交互作用不顯著。

2.2.4 響應面最優(yōu)條件預測與驗證 利用響應面法得到體系最佳檢測條件：氫氧化鈉濃度0.041 mol/L，魯米諾濃度5.088 mmol/L，過氧化氫濃度0.663 mol/L，納米氧化銅濃度159.007 mg/L，此時預測體系化學發(fā)光強度141 135.109。為滿足實際操作需求，將檢測條件適當調(diào)整：氫氧化鈉濃度0.04 mol/L，魯米諾濃度5.0 mmol/L，過氧化氫濃度0.6 mol/L，納米氧化銅濃度160 mg/L。在該最優(yōu)條件下對體系發(fā)光強度平行測定3次，得出實際化學發(fā)光強度136 937，與預測值偏差2.97%，說明響應面建立的模型真實可靠，得出的最優(yōu)條件可以應用于實際測量。

2.3 共存物干擾試驗結(jié)果

考慮到實際檢測時常見離子對體系發(fā)光會產(chǎn)生影響，試驗評估了可能的共存離子的干擾作用。測定結(jié)果顯示，在最優(yōu)試驗條件下，當毒黃素濃度為0.1 mg/L時，且允許其他離子對光強測定影響不超過±5%時，10 000倍Na+，Cl-，Ca2+不干擾毒黃素測定，500倍NO2-，100倍HCO3-、CO32-、SO42-、K+、Fe3+對測定無影響，55倍Mg2+不干擾測定，30倍CH3COO-不干擾測定，4倍Fe2+以及1倍Cu2+對毒黃素測定無影響。為了消除可能出現(xiàn)的離子對體系測量產(chǎn)生的干擾作用，以課題組前期研究結(jié)果為依據(jù)，在每100 mL樣品溶液中添加1 mL的75 mg/L EDTA，其作為掩蔽劑可以有效減少其他離子對測定的影響[22]。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果

2.4 標準曲線、精密度與檢出限結(jié)果

在最優(yōu)試驗條件下，將毒黃素濃度和化學發(fā)光強度分別作為橫、縱坐標，繪制標準曲線。毒黃素濃度在0.005～5.000 mg/L范圍內(nèi)與光強線性關系較好，線性方程y=-1 407.7x+136 438，R2=0.993。對0.05 mg/L毒黃素平行測定11次，相對標準偏差0.28%，表明儀器精密性好，數(shù)據(jù)結(jié)果可信。根據(jù)IUPAC規(guī)定[23]，檢出限以濃度表示，指由特定分析步驟能合理檢測出的最小分析信號所對應的最低濃度。以3倍標準偏差計算的方法計算出方法檢出限0.001 mg/L。

2.5 加標回收測定結(jié)果

以某品牌瓶裝礦泉水、宿舍桶裝純凈水以及蒸餾水為樣本，在優(yōu)化試驗條件下測定其中毒黃素含量，再加標測回收率。表4表明，樣本加標回收率在84%～114%。其中礦泉水加標回收率過高，可能是礦泉水中含有的部分金屬離子干擾了體系發(fā)光，使回收率偏高。

2.6 反應機理探討

為了探討毒黃素對魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅體系抑制作用的反應機理，對不同混合溶液進行了紫外波譜掃描(見圖5)。納米氧化銅和過氧化氫無吸收峰，毒黃素在256.7 nm和394 nm處有兩個吸收峰，魯米諾在301 nm和351 nm處有兩個吸收峰。其中魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅體系吸收峰與魯米諾—過氧化氫吸收峰重疊，說明納米氧化銅加入體系后僅起到催化作用而不參與反應。魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅—毒黃素混合溶液與魯米諾—毒黃素混合溶液均在321 nm處出現(xiàn)了一個新吸收峰，同時過氧化氫—毒黃素混合溶液、納米氧化銅—毒黃素混合溶液吸收峰與毒黃素溶液吸收峰重疊，說明毒黃素并不與體系中過氧化氫、納米氧化銅進行化學反應，而是與體系中的反應劑魯米諾進行化學反應?；隰斆字Z—過氧化氫發(fā)光體系機理：3-氨基鄰苯二甲酸根離子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過程中，以光子形式釋放出能量從而產(chǎn)生熒光被儀器捕捉到光信號[24]，由此可推斷：當毒黃素加入該發(fā)光體系后，魯米諾與毒黃素反應產(chǎn)生了新物質(zhì)，正是該物質(zhì)導致了化學發(fā)光強度變化。因此推斷毒黃素與魯米諾反應產(chǎn)生的新物質(zhì)可能減少了發(fā)光體從激發(fā)態(tài)變?yōu)榛鶓B(tài)時釋放的能量，從而抑制了光強。

表4 加標回收率試驗結(jié)果

圖4 各因素交互作用的響應面分析結(jié)果

a. 魯米若—過氧化氫—納米氧化銅—毒黃素 b. 魯米若—毒黃素 c. 魯米諾—過氧化氫 d. 魯米諾—過氧化氫—納米氧化銅e. 過氧化氫—毒黃素 f. 納米氧化銅—毒黃素 g. 毒黃素h. 過氧化氫 i. 納米氧化銅

圖5 紫外—可見吸收光譜圖

Figure 5 UV-Vis absorption spectrum of chemiluminescence system

3 結(jié)論

毒黃素對魯米諾—過氧化氫發(fā)光體系的發(fā)光強度具有顯著抑制作用，納米氧化銅可強化這一作用并產(chǎn)生光增敏效果?；谶@一原理，建立了一種用于飲水中可能發(fā)生的毒黃素突發(fā)性污染監(jiān)測新方法。該方法可監(jiān)測飲水中黃毒素在0.005～5.000 mg/L范圍內(nèi)的變化情況，監(jiān)測條件為氫氧化鈉濃度0.04 mol/L，魯米諾濃度5.0 mmol/L，過氧化氫濃度0.6 mol/L，納米氧化銅濃度160 mg/L。與流動注射進樣聯(lián)用，可實現(xiàn)在線監(jiān)測，適用于飲水中毒黃素突發(fā)性污染的快速預警。