王 靜 付 晶 李曉偉

(1. 滄州職業(yè)技術(shù)學院，河北 滄州 061001；2. 河北大學，河北 保定 071002)

WRKY基因家族是高等植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。1994年Ishiguro等[1]從甘薯中克隆了第一個WRKY蛋白，近年來隨著越來越多植物基因組的公布，不同物種間大量的WRKY成員在相繼得到克隆和鑒定[2]。WRKY基因編碼的蛋白除了WRKYGQK核心序列外，還存在保守的鋅指結(jié)構(gòu)[2]。依據(jù)WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域及鋅指基序數(shù)量和模式的不同，WRKY蛋白分為3個亞類，其中第Ⅰ類含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ類和第Ⅲ類雖只含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，但第Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2H2，而第Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2HC[3]。

作為重要的轉(zhuǎn)錄因子成員，植物WRKY蛋白已被證明參與對生物和非生物脅迫的響應以及發(fā)育過程[3]。有研究表明，WRKY蛋白不僅在抵抗細菌、真菌和病毒病原體等生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，還廣泛參與了胚發(fā)生[6]、衰老[7]、休眠[8]、毛狀體發(fā)育[9]、種子發(fā)育[10]等過程，以及由植物激素如赤霉酸[11]、脫落酸(ABA)[12]或水楊酸[13]介導的一些信號轉(zhuǎn)導過程。同時，有證據(jù)[14]表明WRKY蛋白參與了對各種非生物脅迫的響應。在擬南芥中過表達AtWRKY28蛋白可提高植物對多種非生物脅迫的抵抗力[15]；在水稻中過表達來自玉米的ZmWRKY114蛋白可提高陽性植株對鹽脅迫的耐受性；在水稻中過表達OsWRKY42蛋白雖然對生物脅迫無效果，但顯著延緩胼胝質(zhì)降解并增強對鹽脅迫的耐受性[16-17]。

雖然植物WRKY蛋白的研究已取得了很大的進展，但對這個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)家族的了解仍然有限。大豆是重要的農(nóng)作物，是人類植物蛋白質(zhì)、食用油和其他有益于健康的營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源[18]。目前有多個團隊[19-20]鑒定了大豆的WRKY蛋白家族，但主要是根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的電子鑒定。試驗擬利用PCR技術(shù)克隆GmWRKY86，并利用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同組織及非生物脅迫下的表達模式，為進一步分析該基因的生物學功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

大豆(Glycinemax)：富豆7號，黑龍江天昊種業(yè)有限公司；

總RNA快速提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒：北京百泰克生物科技有限公司；

ZT4-Blunt快速克隆試劑盒、qRT-PCR Mix試劑盒：北京莊盟生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

紫外分光光度計：UV-360型，北京金石生物技術(shù)有限公司；

梯度PCR儀：MP60201型，珠海莫納生物科技有限公司；

熒光定量PCR儀：Lightlyder 2.0(RoChe)型，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；

微孔板離心機：GC60101型，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

正常田間管理，植株生長30 d后，收集根、莖和葉組織，待植株開花后，收集花器官，用于RNA提取。幼苗生長30 d后，用50% PEG6000和200 mmol/L NaCl溶液進行干旱和鹽脅迫處理，處理1，3，5，7 d后取上部葉片進行基因表達分析。每個樣品取3個生物學重復。

1.3 大豆總RNA提取及cDNA第一鏈合成

1.3.1 大豆總RNA提取 采用總RNA快速提取試劑盒Ultrapure RNA提取。使用UV-360紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。

1.3.2 cDNA第一鏈合成 采用含DNase的Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒對總RNA進行去除基因組DNA，再通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4 GmWRKY86基因的克隆

設(shè)計引物GmWRKY86-F：5′-ATGTCCACTCCCAACACCGATTC-3′和GmWRKY86-R：5′-TTATACTATG ATTTGCTCTT CTTTCA-3′擴增GmWRKY86的ORF序列，以大豆葉片的cDNA作為第一鏈為模板，進行PCR鏈式聚合反應，再使用零背景ZT4-Blunt快速克隆試劑盒對PCR產(chǎn)物進行連接，將獲得的陽性克隆送往上海美吉生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 生物信息學分析

利用DNAMAN7預測GmWRKY86蛋白的等電點和分子質(zhì)量；使用SMART在線預測分析保守區(qū)，利用NCBI中的BlastP程序進行氨基酸一致性分析。進化樹的構(gòu)建采用iTOL在線軟件操作。

1.6 熒光定量PCR分析

設(shè)計GmWRKY86基因熒光定量引物，GmWRKY86-qF：5′-TGGAAATGTAACTGTTCAGCC-3′和GmWRKY86-qR：5′-TCACTTGACCCAGGTAGTAGTTG-3′。大豆肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因，引物序列為5′-CTTCCCTCAGCACCTTCCAA-3′和5′-GGTCCAGCTTTCACACTCCAT-3′，熒光定量反應體系根據(jù)2×SYBR qPCR Mix說明書進行操作。試驗過程中選用LightCycler 2.0 (RoChe)型PCR進行分析，需要重復3次試驗操作。目的基因的mRNA水平采用2-ΔΔCT方法給予分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmWRKY86克隆及分析

課題組前期從鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到多個差異表達的GmWRKY成員，其中GmWRKY86變化模式最為顯著。利用大豆葉片的cDNA對GmWRKY86基因進行克隆。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)GmWRKY86基因包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，其開放閱讀框長度為1 572 bp，編碼523個氨基酸，所編碼蛋白質(zhì)的等電點為8.15，預測分子量為56.82 kDa。在Smart平臺對其氨基酸序列分析，結(jié)果表明GmWRKY86蛋白含有2個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，分別位于第228～286個氨基酸和第409～468個氨基酸(圖1)?；蚪M定位分析表明GmWRKY86定位于大豆基因組Chr08：20546448～20551296 reverse位置，含有3個內(nèi)含子組成和4個外顯子(圖2)。

為了進一步分析該基因功能，從NCBI獲取陸地棉(Gossypiumhirsutum，AIE43850)、麻楓樹(Jatrophacurcas，KT935498)、苦蕎(Tartarybuckwheat，MK910374)、玉米(Zeamay，AIB05859)、野生棉(Gossypiumaridum，AIY62459)、水稻(OryzaSativa，AAT84154)、橡膠樹(Heveabrasiliensis，AEE81757)、草莓(Fragariavesca，APP13924)、葡萄(Vitisvinifera，AY596466)、高粱(Solanumlycopersicum，ADZ15316.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_193551.1) 11個物種的經(jīng)功能鑒定的WRKY成員，與大豆的GmWRKY86蛋白構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示這些成員可分為3個亞類，GmWRKY86蛋白與來自草莓的FvWRKY42蛋白和葡萄的VvWRKY2蛋白聚為一支(圖3)。

圖1 GmWRKY蛋白在大豆中的WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2 大豆GmWRKY86蛋白結(jié)構(gòu)

圖3 GmWRKY86蛋白進化樹分析

2.2 GmWRKY86的組織特異性分析

為了進一步分析該基因功能，用熒光定量PCR方法分析了該基因的表達模式。結(jié)果顯示：在所有檢測的大豆組織中都存在GmWRKY86基因表達，其中在花中的表達量最高，種子中的表達量最低，其他組織中的表達量依次為葉>根>莖，提示GmWRKY86基因可能在大豆根莖葉感知逆境信號和激素信號中發(fā)揮重要作用，也說明GmWRKY86基因在大豆中廣泛發(fā)揮功能(圖4)。

圖4 GmWRKY86基因在大豆不同器官中的表達

2.3 非生物脅迫對GmWRKY86表達的影響

為了進一步分析該基因的功能，利用熒光定量PCR技術(shù)分析了干旱和鹽脅迫前后該基因的相對表達量。結(jié)果顯示，GmWRKY86均能被干旱和鹽脅迫誘導表達，其中在第7天時鹽脅迫下的表達量為第0天的4倍左右，而同時期干旱脅迫下的表達量不到第0天的2倍(圖5)，表明該基因?qū)}脅迫更為敏感。Wei等[21]在擬南芥中過表達草莓的FvWRKY42基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中的SOD和CAT酶活顯著上升，并提高了對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受力。Mzid等[22]發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達草莓的VvWRKY2蛋白也可以提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受力。試驗結(jié)果表明GmWRKY86蛋白在抵抗鹽脅迫和干旱脅迫方面可能具有類似的功能。

圖5 干旱和鹽脅迫下GmWRKY86基因的表達

3 結(jié)論

試驗采用PCR和熒光定量方法，對大豆GmWRKY86基因進行了克隆和表達分析，發(fā)現(xiàn)GmWRKY86基因含有兩個典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)保守性決定了功能的特異性，在GmWRKY蛋白進化樹分析基礎(chǔ)上，研究顯示大豆GmWRKY86蛋白與來自草莓的FvWRKY42和葡萄的VvWRKY2聚為一支，進一步的組織特異性分析及干旱和鹽脅迫前后該基因的相對表達量分析，明確了大豆GmWRKY86蛋白在抵抗鹽脅迫和干旱脅迫方面發(fā)揮了重要作用。鹽脅迫和干旱會嚴重影響作物生長、滲透調(diào)節(jié)和光合作用，降低作物產(chǎn)量。因此，了解干旱和鹽脅迫的分子機制是生產(chǎn)此類作物的先決條件。但深刻闡述大豆GmWRKY86基因功能和分子機制，還需使用多種試驗方法，包括轉(zhuǎn)基因大豆過表達或CRISPR-Cas9缺失表達，以進一步揭示大豆WRKY基因家族和GmWRKY86生物學功能、分子機制和調(diào)控通路。