劉 哲 劉志華 王亞明 張鳳梅

(1. 昆明理工大學化學工程學院，云南 昆明 650106；2. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231)

可可(TheobromacacaoL.)是一種梧桐科常綠喬木，主要產(chǎn)于中南美洲、西非及東南亞等地，中國從20世紀20年代開始引進種植?？煽啥辜纯煽晒麑嵎N子，通常每顆果實含有30～50粒種子?？煽啥乖诎l(fā)酵[1-3]、烘焙[4-6]等加工處理前，一般不具有風味表現(xiàn)。Jinap等[7]研究發(fā)現(xiàn)可可豆在發(fā)酵過程中會受到內(nèi)源性羧肽酶的影響，生成各種肽類物質(zhì)和其他引起香味變化的揮發(fā)性物質(zhì)；Hii等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當烘焙溫度為120～150 ℃時，伴隨美拉德反應[9]的產(chǎn)生，生成更多含氮、含氧的可可豆特征風味物質(zhì)；Acierno 等[10]基于HS-PTR-MS的方法，證實了生長環(huán)境等對可可豆品質(zhì)的影響；Eskes等[11]對可可豆風味成分的形成進行分析，發(fā)現(xiàn)2-戊醇是形成可可豆的果香味和醇香口味的主要特征香氣物質(zhì)，乙酸仲丁酯是形成可可豆花香和清甜香的主要特征香氣物質(zhì)。上述研究主要針對引發(fā)可可豆特征風味的物質(zhì)，但可可豆加工過程中會產(chǎn)生類似甘草風韻的苦澀口味，對后續(xù)制成可可類食品不利，主要通過添加輔料來掩蓋苦澀口感[12]，目前針對可可豆苦澀形成機理及烘焙溫度對苦澀味物質(zhì)含量的影響尚未見報道。

試驗擬對不同烘焙溫度下的可可豆風味物質(zhì)進行分離分析，重點分析可可豆苦澀味形成的原因，并利用熱裂解溫度升高的方法模擬烘焙溫度對可可豆揮發(fā)性成分的影響，分析熱解產(chǎn)物中苦澀味相關物質(zhì)含量，以期為提高烘焙工藝中的可可豆風味品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

可可豆：云南中煙技術中心香精香料所；

凝膠色譜柱：瑞士Buchi公司；

Sephadex LH-20填料：瑞典GE Healthcare公司；

蒸餾水：10 MΩ，屈臣氏集團(香港)有限公司；

乙醇：色譜純，迪科馬科技(北京)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

振蕩器：HY-5型，金壇中大儀器廠；

混合型碾磨儀：RS200型，德國 Retsch公司；

旋轉蒸發(fā)儀：R-210型，瑞士Buchi公司；

分析天平：感量0.000 1 g，德國Sartorius公司；

冷凍干燥機：2-4D型，德國Christ公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A/5975C型，美國Agilent公司；

液相色譜：1200型，配自動餾分收集器，美國Agilent公司；

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A/5975C型，德國Bruker公司；

CTC多功能自動進樣器：Combi-xt PAL型，瑞士Combi-PAL公司；

熱裂解儀：CDS5200型，配CIS3冷進樣系統(tǒng)，美國CDS公司；

氣相色譜儀：Clarus 600型，配Clarus 600 MS質(zhì)譜檢測器，美國Perkin Elmer公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 可可豆提取物的制備 參照文獻[9]的方法并略作修改。選取顆粒飽滿未發(fā)酵可可豆，分別在110，120，130，140，150，160 ℃下烘焙30 min，粉碎，取10 g可可豆粉末，置于200 mL具塞錐形瓶中，加入125 mL乙醇于室溫下振蕩1 h，使用濾紙過濾，濾液轉移至250 mL茄形瓶中，再用10 mL乙醇洗滌濾渣，將洗滌液與濾液合并，于旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至黏稠狀且表面無溶劑，即得可可豆提取物。

1.2.2 可可豆提取物水溶物的制備及分離 將葡聚糖凝膠用純凈水充分溶脹后，裝填層析柱(2.6 cm×100 cm)，以水為流動相平衡24 h以上。取以50 g可可粉為原料提取的提取物，用60 mL蒸餾水溶解，過濾，濾液于-40 ℃冷凍后置于通風處干燥24 h，得到棕色黏稠狀物即為可可提取物的水溶物。將水溶物溶于20 mL蒸餾水中，進行柱層析，以蒸餾水為流動相，流速1 mL/min，按時間連續(xù)收集，每個流分收集10 mL，共收集40個流分。

1.2.3 可可豆苦澀風味成分確認 按式(1)計算香氣活力值(OAV)[13]。

(1)

式中：

OAV——香氣活力值，kg/mL；

C——各香氣組分的濃度，mg/mL；

T——感覺閾值，mg/kg。

OAV>1，說明該組分對整體香味貢獻較大；OAV<1，說明該組分對整體香味影響很小。由于積分面積歸一化法只能得到單一組分的相對濃度(Cr)，將式(1)中的絕對濃度(C)替換成相對濃度(Cr)，引入相對氣味活力值(ROAV)，然后根據(jù)各組分相對含量與查閱到的感覺閾值[14]的比值進行比較，比值最大的即OAV值最大的香氣組分。按式(2)計算相對氣味活力值。

(2)

式中：

ROAV——相對氣味活力值；

OAVn——單一組分的香氣活力值，kg/mL；

OAVmax——香氣活力值最大組分的香氣活力值，kg/mL；

Cn——單一組分的相對含量，%；

Cmax——香氣活力值最大組分的相對含量，%；

Tn——單一組分的閾值，mg/kg；

Tmax——香氣活力值最大組分的閾值，mg/kg。

通過式(2)得出的相對氣味活力值為0～100，且ROAV>1.0的組分為整體致香的關鍵組分，0.1

1.2.4 可可豆苦澀味流分分析 由6位評價人員通過直接嗅聞的方式對各流分的嗅覺特征進行辨識，獲得具有嗅覺特征的流分，有4位以上評價人員結論一致時，辨識結果方被接受。將收集到的40個流分按照風味表現(xiàn)分類，然后對苦澀味的流分進行合并，使用頂空固相微萃取結合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析合并流分的揮發(fā)性成分。

1.2.5 可可豆苦澀味復配 根據(jù)揮發(fā)性成分測定結果，挑選具有苦澀味或焦味的物質(zhì)，根據(jù)文獻[14]查詢閾值，計算相對活力值，對以上篩選后的風味物質(zhì)進行相對香氣活力值計算，以ROAV>0.1的組分作為可可苦澀味的致香的關鍵組分進行重組復配及風味重組試驗，然后對合并流分和重組模型進行感官評價。

1.2.6 可可豆提取物苦澀味流分和重組模型的風味特征評價 由6位感官評價人員通過直接嗅聞的方式，對分離出苦澀味的合并流分以及復配后的風味重組模型進行感官評價，評價標準為清甜香、正甜香、焦甜香、木香、焦香、苦澀香6個香韻特征，分值均為0～5分，分值越高說明強度越大，結果取6位感官評價人員的品吸分數(shù)平均值。

1.2.7 可可豆分段熱解分析 準確稱取可可豆粉末(1.0±0.5) mg于熱裂解石英管中，并用石英棉堵塞石英管兩端，將石英管裝入熱裂解儀。

(1) 裂解條件：裂解探針初始溫度50 ℃，以5 ℃/s的速率分別升至110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160 ℃。各級附件初始溫度50 ℃，終溫200 ℃，保持5 min。吸附肼溫度30 ℃，脫附溫度260 ℃，裂解輔助氣為氮氣(N2)。

(2) 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件：DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱，進樣口溫度250 ℃，氦氣流速1 mL/min；升溫程序為起始溫度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持10 min；分流比30∶1，總運行時間97.67 min。

(3) 電離方式：電子源轟擊(EI)；離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電離能70 eV，質(zhì)量掃描范圍40～400 amu，溶劑延遲3 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS數(shù)據(jù)由Nist05.d 標準譜庫檢索定性，揮發(fā)性物質(zhì)的香氣成分采用峰面積歸一化法，以各化合物色譜峰面積相對百分比表示其相對含量，使用Origin 8.5對數(shù)據(jù)進行分析和圖像處理。

2 結果與討論

2.1 可可豆提取物苦澀味流分篩選和致苦物質(zhì)確認

2.1.1 苦澀味流分分離 由表1可知，對可可豆提取物進行風味物質(zhì)分離時，按時間分離的順序依次為醇香味、脂香味、焦甜香味、苦澀味和焦糊味，編號為26～34的流分表現(xiàn)出苦澀味特征，即試驗所需的可可豆提取物苦澀味流分。

2.1.2 苦澀味流分分析 將苦澀味流分合并，根據(jù)文獻[15]的固相微萃取條件選取粉色(65 μm，PDMS/DVB，Stableflex 24 Ga)的萃取頭，80 ℃下萃取30 min，解吸3 min，對合并流分進行頂空萃取結合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。由表2可知，未烘焙的可可豆揮發(fā)性物質(zhì)總相對含量要高于烘焙后的可可豆，但3-甲基丁醇、2-甲基丙醇等苦澀味的物質(zhì)含量也要高于烘焙后的可可豆，符合美拉德反應的特征，溫度升高對可可豆提高醇香有一定的促進作用。

表1 可可豆提取物苦澀味流分的香味特征

表2 不同烘焙溫度下苦澀味流分各物質(zhì)的相對含量?

續(xù)表2

種類化合物名稱保留指數(shù)苦澀味流分物質(zhì)的相對含量/%未烘焙110 ℃120 ℃130 ℃140 ℃150 ℃160 ℃香氣類型酯類庚酸乙酯1 3260.040.040.010.000.000.290.29果香苯甲酸乙酯1 6400.270.230.600.000.090.120.77甘菊香、水果香丁內(nèi)酯1 5910.090.410.000.070.362.090.27焦糖香、奶酪香、烤堅果香、甜味乙酸苯乙酯1 7870.110.290.010.00-0.012.21花香、煙草香呋喃類2-甲基呋喃 8150.040.000.050.000.020.05--乙烯呋喃9580.050.04-0.000.020.09-煙味2-戊基呋喃1 2130.060.00-0.000.780.000.01黃油味、綠豆香2、5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮2 032-0.080.240.450.680.691.12燒焦味、焦糖香、甜香醛類2-甲基丙醛 8270.010.270.380.290.410.790.82燒焦味、焦糖香、3-甲基丁醛9190.270.020.000.010.000.000.06可可香、鮮草香、麥芽香、辛辣味戊醛9571.580.010.020.00-0.00-杏仁味、苦味、辛辣味(E)-2-甲基-2-丁烯醛1 0890.030.010.020.000.030.000.00-辛醛1 2720.110.010.000.050.020.000.00柑橘味、油脂味、青草香、辛辣味苯甲醛1 4944.253.963.640.013.450.011.29苦杏仁味、焦糖香α-亞乙基苯乙醛1 8920.000.020.000.040.000.000.00可可香、烤香、甜香5-甲基-2-苯基-2-己烯醛2 0420.070.000.010.010.010.010.01可可香酮類2-戊酮 96112.410.03--0.01--燒焦味、水果味、辛辣味2,3-二戊酮1 0500.27-0.091.051.850.950.92苦味、黃油味、焦糖香、奶油香(E)-3-戊烯-2-酮1 1120.110.780.040.180.08-0.01-2-辛酮1 2730.090.060.110.220.100.540.03芳香、皂香苯乙酮1 6180.040.020.040.070.110.060.44杏仁味、花香甲基環(huán)戊烯醇酮1 8000.050.04-0.150.110.160.03香油味、甜香烯烴β-月桂烯1 1540.060.050.600.030.480.040.09果香、花香、香草味D-檸檬烯1 2050.010.080.800.040.010.670.04柑橘香、薄荷香吡嗪類甲基吡嗪1 2510.140.061.890.021.130.260.11可可香、青草香、烤香2、5-二甲基吡嗪1 306-0.380.690.671.242.374.15燒焦味、可可香2、6-二甲基吡嗪1 3140.330.07-0.830.04-0.00可可香、青草香、咖啡香乙基吡嗪1 3180.480.02-0.520.250.390.47燒焦味2、3-二甲基吡嗪1 3300.710.060.022.280.020.150.00焦糖香、可可香2、3-二甲基-5-乙基吡嗪1 4031.100.00-0.60-0.860.97燒焦味、綠豆香2、6-二乙基吡嗪1 4170.281.100.130.020.030.01-青草香3、5-二乙基-2-甲基吡嗪1 4750.070.010.000.040.000.010.00烤香、可可香、甜香其他吡啶1 1710.04--0.09-0.130.26燒焦味、辛辣味1-乙?；量┩? 8050.090.03-0.020.020.000.00-2-甲氧基苯酚1 8260.140.02--0.380.550.67燒焦味、藥香、煙味麥芽酚1 9300.240.000.120.010.250.030.01焦糖香、麥芽香、烤面包香、烤堅果香2-乙酰吡咯1 9900.070.020.050.150.020.03-面包香、可可香、榛子味、甘草香、烤香2、3-二氫-3、5-二羥基-6甲基-4H-吡喃-4-酮2 253--0.03-0.071.241.58苦味、土腥味、香草味、烤香

? “-”表示未檢測到或香氣特征未知。

由表3可知，相對活力值的關鍵組分為2-甲基丙醛，2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮，但這些物質(zhì)多數(shù)相對含量要遠低于修飾組分中的某些物質(zhì)。在化合物相對含量一定的情況下，閾值越低，即嗅覺辨識該物質(zhì)的最低濃度越低，則相對香氣活力值越大，對參與物質(zhì)風味形成的貢獻也就越大。

表3 苦澀味或焦味物質(zhì)的閾值和ROAV?

? “-”表示未查閱到。

2.1.3 可可豆苦澀味復配與感官評價 篩選風味物質(zhì)時，將每種單一組分的風味表現(xiàn)作為參考，從苦澀味流分中僅挑選出表現(xiàn)苦澀味或焦味的物質(zhì)，如苯乙酮、丁內(nèi)酯、麥芽酚等感官體驗上脂香和甜香味明顯高于苦澀味的組分同樣不參與重組試驗。由圖1可知，重組模型的木香和焦香味與原流分差別較大，但苦澀味和甜香相似度較高，因此可認為2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮、3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪及2-甲基丙醇12種物質(zhì)是形成可可豆苦澀味的主要致香組分。

圖1 原流分與重組模型的苦澀味感官評價雷達圖

Figure 1 Sensory evaluation radar chart of bitter taste of original sample and reconstituted model

2.2 模擬不同烘焙溫度下可可豆的分段熱裂解對比分析

由圖2可知，隨著烘焙溫度的升高，伴隨著美拉德反應，可可豆揮發(fā)性成分的物質(zhì)種類和相對含量也隨之發(fā)生變化，主要有醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、烯烴類和其他吡嗪類化合物[16]。未烘焙和145 ℃下烘焙的可可豆分別檢測出69，85種化合物，說明不同烘焙溫度對可可豆的熱解產(chǎn)物有較大影響，在一定范圍內(nèi)，溫度越高，可可豆的揮發(fā)性產(chǎn)物越多。

圖2 不同烘焙溫度下可可豆的色譜圖

由圖3可知，在不影響可可豆原有風味的前提下，減少致苦澀味關鍵組分[2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮]和致苦澀味修飾組分(3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基丙醇)的含量便可有效降低可可豆中苦澀味對口感的影響。當熱解溫度為110～120 ℃時，可可豆揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量均有所上升，說明在此溫度范圍內(nèi)進行烘焙，可增進可可豆的香味，但致苦澀組分含量也有所上升(從8.84%上升到10.18%)，說明此溫度下烘焙的可可豆風味并未滿足要求。當熱解溫度為130～135 ℃時，致苦澀組分和其他組分的相對含量分別達到最低值(4.78%)和最高值(74.62%)。故在不影響可可豆原有風味的前提下，若要將可可豆的苦澀味最大程度地減少，烘焙溫度應控制在130～135 ℃。當熱解溫度為135～160 ℃時，可可豆粉末的致苦澀組分和其他風味組分分別出現(xiàn)上升、下降趨勢，說明該溫度烘焙的可可豆風味已受到影響。

圖3 不同熱解溫度下可可豆粉末各組分的相對含量變化

Figure 3 Change of relative content of cocoa powder components under different pyrolysis temperature

3 結論

① 可可豆提取物苦澀味流分共檢測出55種揮發(fā)性成分，其中醇類7種，酸類5種，酯類9種，醛類8種，酮類6種，烯烴類2種；② 致苦澀味的關鍵組分為2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮，修飾組分為3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基丙醇；③ 130～135 ℃為降低可可豆苦澀味的最佳烘焙溫度。

目前已知可可豆揮發(fā)性成分高達500余種[17]，主要有醇類、醛類、酮類、酯類和一些酸類物質(zhì)，每種成分可能都與可可豆的風味形成有著密切的關系，試驗將已檢測出的其他揮發(fā)性成分相對含量加和與致苦澀組分進行比較分析，將影響可可豆風味的因素與其他物質(zhì)的總含量變化關聯(lián)，但實際烘焙過程中溫度對可可豆單一風味物質(zhì)變化影響需進一步研究分析。